改良法秋水仙素处理技术在染色体畸变分析实验中应用的比较性研究

陈洋

（惠州市职业病防治院，广东 惠州 516008）

改良法秋水仙素处理技术在染色体畸变分析实验中应用的比较性研究

陈洋

（惠州市职业病防治院，广东 惠州 516008）

目的在染色体畸变分析实验中，探讨与常规方法相比较改良法秋水仙素处理技术的应用价值。方法采取30份样本，每份标本分成两份，分别采用A方法(常规法)和B方法（改良法）进行细胞培养和秋水仙素处理。然后均给予细胞收集、离心、固定、制片和染色等步骤。镜检计算每种方法的有丝分裂指数。然后利用SPSS 17.0 软件进行t检验分析（P＜0.05时有统计学差异）。结果两种方法处理后的细胞均生长良好，分裂指数高，均能够满足分析要求。两种方法所得有丝分裂指数比较，无统计学差异（P＞0.05）。结论改良法秋水仙素处理技术具有秋水仙素用量少，毒性低，可控性好等优势，且实验效果可靠，具有推广价值。

改良秋水仙素处理技术；染色体畸变分析

染色体畸变分析是放射工作人员健康监护和慢性小剂量受众远期医学效应评价的重要指标,是最直接反映辐射损伤的检查项目之一[1,2]。秋水仙素处理是染色体分析实验中关键步骤，常规方法是在细胞培养后加入秋水仙素处理，然后再行收获、制片和染色[3,4]。本实验室根据长期的细胞遗传学工作经验，改良了秋水仙素处理的方法，采取细胞培养同时进行秋水仙素处理，并取得良好的实验结果。现对该实验方法做如下分析。

表1 30份样本经两种方法（A常规法/B改良法）秋水仙素处理后有丝分裂指数比较表(%)

1 材料与方法

1.1 材料

共采取30份样本（均为肝素抗凝外周全血10 mL）、RPMI1640培养基、秋水仙素（20 μg/mL）、低渗液（为0.075 mol/L氯化钾）、磷酸盐缓冲液（由浓度均为1/15 mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以1∶1体积比混合，pH值为6.8）。

1.2 方法

1.2.1 每个样本分成两份，分别采用A方法和B方法进行细胞培养和秋水仙素处理。A方法（常规法）秋水仙处理：用5 mL注射器取血0.3 mL，接种到淋巴细胞培养液中，培养50～54 h后，加入秋水仙素工作液处理3 h（终浓度为0.07 µg/mL）。B方法（改良法）秋水仙处理：用5 mL注射器取血0.3 mL，接种到己融化好的培养基中，同时加入秋水仙素工作液（终浓度为0.03 µg/mL），将培养基混匀，置于37 ℃恒温培养箱中，培养50～54 h。

1.2.2 首先收集细胞，将培养基倒入10 mL离心管中，1000 rpm/min离心6 min。弃上清液，加入低渗液8 mL，用滴管轻打混匀，于温箱中静置15 min。预固定：加入固定液1 mL，轻轻混匀。以1000 rpm/min离心6 min。固定：弃上清液，加入固定液8 mL混匀，静置20 min，然后以1000 rpm/min，离心6 min。再次固定，弃上清液，加入6 mL固定液，静置20 min，然后以1000 rpm/min，离心6 min。弃上清后，依细胞数量多少加入适量固定液，约0.2 mL，备用。

1.2.3 制片：取细胞悬液滴在备用的湿冷玻片上，在酒精灯上过火，写上编号。

1.2.4 Giemsa染色：Giemsa染液与磷酸缓冲液制成5%的工作液，把晾干的载玻片反盖在上面（细胞面朝下），将制备好的工作液灌满染色槽，排出气泡，染色20 min后用自来水冲片，气干。

1.2.5 镜检：在低倍镜下寻找分散良好，长短适中的分裂相，换用油镜对其进行细致观察，每张片计数200个分裂相。计算每种方法的有丝分裂指数。

1.2.6 统计学分析：本实验数据为计量数据，自身配对实验设计，利用SPSS 17.0 软件进行t检验（P＜0.05时有统计学差异）。

2 结 果

2.1 制片后镜下观察细：镜下观察，两种方法处理后的细胞均生长良好，分裂指数高，能够满足分析要求，染色体分散均匀，着色良好，长短适中，两条姐妹染色体大致平行分离，着丝粒清晰。根据每条染色体的大小和着丝粒的位置，可区分中央着丝粒染色体、亚中央着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。如下是制备完成的分散良好的染色体图片（图1和图2）。

图1 A常规法制片染色后光镜下所见

图2 B改良法制片染色后光镜下所见

2.2 30份样本经两种方法（A常规法/B改良法）秋水仙素处理后有丝分裂指数比较表，见表1。经SPSS 17.0 软件计算后结果，见表2和表3。

表2 成对样本统计量

表3 成对样本检验

经过统计学运算，P＞0.05，可见两种方法所得有丝分裂指数比较，无统计学差异。

3 讨 论

总所周知，常规法秋水仙素处理已经在染色体畸变研究中得到广泛的使用，其可靠性毋庸置疑[5]。但由于该方法实验过程中需要多时间点监控，所以各实验室在开展该项技术的初期，经常会花费较多时间去摸索实验条件，故学习曲线较长，不利于实验技术的推广。我们实验室经过长期经验积累，总结出改良法秋水仙素处理技术，实践证明效果很好，通过上述实验数据的统计学分析，我们可以看出，两种方法在实验结果方面并没有明显的统计学差异，也就是说利用改良法秋水仙素处理可以得到和常规方法相同的实验结果。

在实践过程中，我们也可以看到，改良法具有以下几方面的优势：①减少秋水仙素的用量和浓度，可以减少秋水仙素的毒性所致的细胞毒作用。秋水仙素使用：我们将秋水仙素于接种时即与标本混合，我们认为这样的好处首先是接触充分，利于秋水仙素的作用；其次，由于秋水仙素具有细胞毒性，高浓度其镜下表现在可见细胞核及细胞质固缩，着色深紫色，细胞转化率低[6]，培养前混入秋水仙素，可减少秋水仙素的浓度（建议终浓度为0.03 µg/mL）和用量，即减轻其细胞毒作用，是提高实验效能的关键。②操作简便，单时间点控制，便于学习，利于推广。实验方法上我们可以看到常规方法需要控制两个时间节点，即培养结束加入秋水仙素的时间点和秋水仙素作用时间点，两个时间点均须严格把控，稍有失误，就会导致实验失败。而改良法，只需掌握一个时间节点，即培养结束时间，且由于秋水仙素浓度较低，即便时间稍有延长（＜2 h），也不会影响制片效果，也不会导致实验失败。所以改良法更利于学习，利于技术的推广。

综上所述，改良法秋水仙素处理技术便于学习，利于推广，且效果良好，值得推广。

[1] 李小芳,吕玉民.放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变和微核分析[J].河南职工医学院学报,2006,18(5):386-388.

[2] 王喜爱,韩林,王平,等.放射工作人员外周血淋巴细胞微核分析 [J].医药论坛杂志,2008,29(4):32.

[3] 肖正华.改良的人体外周血淋巴细胞的培养与染色体标本的制作技术[J].第三军医大学学报,1994,16(6):450.

[4] 侯艳香.人外周血淋巴细胞培养染色体制备及影响因素[J].检验医学与临床,2013,10(7):874.

[5] 任莉萍,李娟,潘亚丽,等.人的外周血淋巴细胞培养及染色体制作技术[J].生物学通报. 2011,46(3):54.

[6] Ranney DF.Suppression of stimulating cell activity by microtubule-disrupting alkaloids[J].J Supramol Struct,1976,5(3): 335-342.

Comparative Analysis of Improved Colchicines Application Method in Chromosome Aberrations Experiment

CHEN Yang

(Huizhou Occupational Disease Prevention Hospital, Huizhou 516008, China)

ObjectiveTo investigate the value of improved colchicines application method in chromosome aberrations experiment,compared with the conventional method.MethodsTo take 30 samples, each sample was divided into two parts, which were cultured and dealed with Method A (conventional method) and Method B (improved method of). The matured cells, which were collected and centrifuged, with discarding the supernatant, were fixed、dyed and observated at low magnification. The mitotic index were calculated.Then t-test was used with SPSS 17.0 for statistical analysis (P＜0.05 means that there are significant differences).ResultThe cells were cultured well in two ways, with high mitotic index, which were able to meet the analytical requirements. The results means that there were no significant difference (P＞0.05).ConclusionImproved colchicines application method had the advantages of less use dosage of colchicines, less toxicity, better controllability, and reliable experimental results, which had promotional value.

Improved colchicines application method; Chromosome aberrations

R-33

B

1671-8194（2014）16-0063-02