不同精子浓度对长时体外受精结局的影响

宋丽君 陈 碧 韦 冰

广东医学院附属医院生殖中心（湛江 524001）

不同精子浓度对长时体外受精结局的影响

宋丽君 陈 碧 韦 冰

广东医学院附属医院生殖中心（湛江 524001）

目的探讨体外受精-胚胎移植（IVF-ET）过夜受精周期中不同精子浓度对卵子受精与胚胎发育的影响。方法 根据过夜受精周期中不同精子浓度，分为A组（50×104/ml）与 B组（15×104/ml），比较两组的受精率、2原核率（2PN率）、2原核卵裂率（2PN卵裂率）、多原核率（多PN率）、优胚率、临床妊娠率及种植率。结果A 组受精率、2PN率高于 B 组（P＜0.05），而B组优胚率、种植率高于A组（P＜0.05），两组2PN卵裂率、临床妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05）。结论过夜体外受精周期中适当降低精子浓度能提高胚胎质量，从而提高优胚率和种植率，改善临床结局。

受精,体外; 胚胎移植; 妊娠结局

随着宫腔内人工受精（intrauterine insemination, IUI）、体外受精-胚胎移植（in vitrofertilizationembryo transfer IVF-ET）等辅助生殖技术的广泛应用, 有关受精方式及受精浓度对辅助生殖技术治疗结局的影响日益受到人们的关注, 并就此进行了大量研究[1]。本文比较过夜体外受精中两种受精浓度对治疗结局的影响, 探索合适的受精浓度，为临床受精方式及受精浓度的选择提供参考。

资料与方法

一、研究对象

2013年1月至8月在本院生殖医学中心行常规IVF治疗的患者纳入研究。

二、控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation COS）方案

均采用短效长方案，注射短效促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone agonists GnRHa）0.05～0.1mg/d至注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin HCG）日，当垂体达到降调标准开始给予促性腺激素（Gonadotropin Gn）。根据患者的年龄、基础促卵泡激素（follicle stimulating hormone FSH）值、基础窦卵泡数目、体重指数决定Gn启动剂量。监测卵泡发育并测血激素水平，个体化调整Gn用量及确定注射HCG时间，至少1个卵泡直径达19mm时，或2个卵泡直径达18mm时，或3个卵泡直径达17mm，血雌二醇（E2）达到平均每个优势卵泡（≥14mm）250～300 ng/L时，当晚注射HCG 5 000～100 00IU，注射后34～36h取卵。

三、卵母细胞的回收

将1支试管的卵泡液倒入皿中，晃动液面使液体均匀分布在皿中，按照一定顺序认真快速地查找卵冠丘复合体（ovum crown cumulus complexes, OCCS），找卵时，应尽量缩短卵母细胞在非生理条件下的操作时间。将找到的OCCS冲洗后，转至装有受精液的培养皿内，放回培养箱进行成熟培养。

四、精液处理及实验分组

密度梯度+洗涤后上游法处理精液，调精液终浓度为10～20×106/ml 。授精精液浓度分组依据《体外受精－胚胎移植实验室技术》[1]， A组（13次取卵周期）：采用微滴受精，每100μl微滴加5万条精子，调受精浓度约为50×104/ml，2～3卵/微滴；B组（28次取卵周期）：采用四孔皿受精，每孔700μl受精液，每孔加10万条精子，调受精浓度约为15×104/ mL，2～3卵/孔。

五、过夜受精、胚胎培养及优胚标准

均采用过夜受精，HCG注射后39～40h受精，受精后的第二天早上，即加精（17±1）h（剥除颗粒细胞后）观察原核，正常受精卵表现为胞质内有两个原核，可见第二极体。受精后置序贯培养液中培养，（44±1）h、（68±1）h观察D2、D3胚胎形态。胚胎评估：1级为卵裂球大小均匀，无碎片或碎片＜10%；2级为裂球大小不均, 碎片10%～25%；3级 卵裂球大小不均，碎片＞25%或存在多核现象。优胚标准 （D3）：评为1级的7～9细胞，无多核现象，胞质均匀，无颗粒及空泡现象。

六、胚胎移植及随访

受精后第3天选择优胚移植，根据B超监测，置移植外管于宫颈内口，将装载胚胎的内管经外管插入，距宫底约10～20mm处，缓慢注入胚胎，固定注射器活塞避免胚胎回吸。移植后进行常规黄体支持，14d查血HCG阳性，28d B超检查子宫内有孕囊及心管搏动为临床妊娠。

七、统计方法

计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方检验，利用SPSS11.5进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般情况

本中心2013年1月至8月36例不孕患者进行常规IVF，共41次取卵周期，22次新鲜胚胎移植周期。不孕女方患者平均年龄（31.4±4.7）岁，不孕年限（3.8±2.8）年，原发21例,继发19例，平均获卵数（8.6±5.0）枚，平均获卵率（94.1±65.2）%，平均成熟卵（metaphase Ⅱ, MⅡ）数（7.2±4.6）枚，平均卵成熟率为（85.5±18.0）%，平均受精率为（82.3± 20）%，平均2原核率（2PN率）为（71.5±23.4）%，平均多原核率（多PN率）为（5.5±11.0）%，平均2原核卵裂率（2PN卵裂率）为（95.6±16.4）%，平均优胚率为（37.9±34.7）%，新鲜周期妊娠率为50%（11/22），种植率为34.1%（15/44），流产率为9.1%（1/11），多胎（均为双胎）发生率为36.4%（4/11），宫外孕发生率为0。

二、两组一般情况比较

两组患者平均年龄、不孕年限、原发不孕比例、平均获卵数、平均获卵率、平均MⅡ卵数、平均卵成熟率比较均无统计学意义，见表1。

表1 两组一般情况比较

三、两组实验室及临床结局比较

A 组受精率、2PN率高于 B 组（P＜0.05），而B组优胚率、种植率高于A组（P＜0.05），两组2PN卵裂率、临床妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组实验室及临床结局比较

讨 论

目前已经有较多的生殖中心采用了短时受精方式进行体外受精，获得较好临床妊娠率[2,3]。但短时受精过早去除颗粒细胞，对卵母细胞受精过程的刺激是否会引起受精卵异常发育目前尚不明确，目前有一些研究表明缩短精卵孵育时间并不能改善胚胎质量及妊娠率，受精早期脱颗粒细胞的机械刺激会增加多精受精率，对胚胎发育有不利影响[4,5]。本文中36例不孕患者均采用传统的过夜受精方式（精卵共培养16～20 h），平均受精率为82.3%，平均2PN卵裂率为95.6%，平均优胚率为37.9%，新鲜周期妊娠率为50%，种植率为34.1%。本中心通过过夜受精方式，取得较好的临床妊娠率及种植率，提示IVF的这种过夜受精方式具有操作相对简单，不易损伤胚胎等优点，适合在基层医院推广。

影响IVF-ET成功率的因素很多，移植高质量的胚胎是提高妊娠率的关键[6]。过夜受精中，精子数量的多少直接影响卵子的受精率及发育潜能。传统过夜受精所需的精子参数范围尚不清楚，能否在较低的精子浓度下获得更多的优质胚胎是本文的观察目的。本文根据过夜受精周期中不同的受精浓度，分为两组A组（50×104/mL）， B组（15×104/mL），两组患者平均年龄、不孕年限、原发不孕比例、平均获卵数、平均获卵率、平均MⅡ卵数平均卵成熟率比较均无统计学意义（P＞0.05），说明两组患者具有可比性。A组受精率及2PN率高于B组,可能与A组精子浓度相对高有关。多精受精是IVF中常见的异常受精类型，通常是两条或两条以上精子同时进入卵子所致，受精浓度过高可能引起多精受精，但本文B组中受精浓度虽然低，多PN率却高于A组，这可能与B组不成熟卵比例较高有关，不成熟卵或过熟卵皮质反应异常容易导致多精受精的发生，多精受精的出现与卵子成熟度密切相关。邓翎洁的研究也发现在卵泡数及获卵数较多的周期中，容易出现一些不成熟或过熟的卵子，这类卵子发生多精受精的可能性大，多精受精率与受精密度无关[7,8]。

两组2PN卵裂率及妊娠率无差别,但B组优胚率及种植率明显高于A组（P＜0.05）。说明适当降低精子浓度可提高胚胎质量及改善妊娠结局.有研究认为精子代谢会产生活性氧 （reactive oxygen species, ROS）导致透明带硬化，影响胚胎的正常孵出与植入，降低精子浓度可减少ROS，降低其对透明带的影响，使胚胎顺利孵出与植入，提高胚胎的着床率，本文中精子浓度为15×104/mL的B组优胚率及种植率明显高于精子浓度为50×104/mL的 A组,并且B组的妊娠率（63.6%）也高于A组（36.4%），说明降低卵子的受精浓度虽然对受精率略有影响，但优胚率明显增加，从而提高临床妊娠率及种植率。

1 黄国宁, 孙海翔. 体外受精－胚胎移植实验室技术. 北京:人民卫生出版社, 2012

2 刁英, 杨智敏, 谭兵兵, 等. 短时受精并即刻脱颗粒细胞对IVF-ET治疗周期的影响. 中国计划生育学杂志 2011; 19(2): 106-108, 112

3 江楠, 王启钊. 缩短精卵共孵育时间对人类体外受精结局的影响. 中国优生与遗传杂志 2011; 19(3): 7-8, 14

4 宋成, 万才云, 成金泉, 等. 早期去除颗粒细胞对体外受精和胚胎发育的影响. 中国优生与遗传杂志 2013; 21(4): 144-146

5 宋小兵, 张翠莲, 张钦宪. 不同脱颗粒细胞时间对IVFET治疗周期的影响. 当代医学 2013; 19(5): 40-44

6 Anthony N Imudia, l Yoko Suzuk il. Retrieval of trophoblast cells from the cervical canal for prediction of abnormal pregnancy: a pilot study.Human Reproduction2009; 24(9): 2086-2092

7 黄学锋, 张巍. 人类体外受精中的异常受精. 生殖医学2009; 18(3): 184-186

8 邓翎洁, 李柳铭, 翟丹梅. 人类体外受精助孕治疗中多原核受精的相关因素分析. 广西科学院学报 2013; 29(2): 114-11

（2013-09-02收稿）

The effects of different sperm concentrations on the clinical outcome of ovum fertilization and embryo development duringin vitroovernight fertilization cycle

Song Lijun, Chen Bi, Wei Bing
Reproductive Center of Aff liated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang Guangdong 524001, China

ObjectiveTo investigate the effects of different sperm concentrations on the outcome of ovum fertilization and embryo development during in vitro overnight fertilization cycle.MethodsAccording to the different sperm concentrations during overnight fertilization cycle, the patients were divided into Group A (50×104/ml) and B group (15×104/ ml). The fertilization rates, 2 pronucleus(PN) rate, 2 PN cleavage rate, multi-PN rate, excellent embryo rate, clinical pregnancy rate and implantation rate between the two groups were comparatively analyzed.ResultsThe rates of fertilization and 2PN of the group A were higher than those of group B (P<0.05), and excellent embryo rate and implantation rate of the group B were all higher than those of group A(P<0.05), whereas the 2PN cleavage rate and the clinical pregnancy rate between the two groups had no signif cant difference (P＞0.05).ConclusionModerately lowered sperm concentration might improve the excellent embryo rate and implantation rate during the overnight fertilization of IVF, thus ameliorate clinical outcome.

fertilization in vitro; embryo transfer; pregnancy outcom

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.006

R 321-33