正交试验设计优化超声煎煮法提取丹参中丹参素的研究

杨炳火 夏崇才 周芙琼 胡新

丹参是唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎［1］，是临床心血管疾病最常用中药之一。具有活血祛瘀，调经止痛，清心除烦的功效［2-3］。丹参素是丹参水溶性成分中的主要活性成分，现代药理研究表明，丹参素具有心肌保护、神经细胞保护、抗氧化、抗炎和增强免疫力、抗肿瘤、改善微循环等作用［4-5］。超声技术提取中药具有提取效率高、省工、省时等优点［6］，本文将超声与煎煮相结合对丹参素进行提取，并采用正交实验法筛选最佳提取工艺，同时与煎煮法比较，考察提取效果。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1290 Ⅰnfinity 超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Agilent VWD 型检测器(美国安捷伦公司);KQ-300DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);FA1104 电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司);1612-1 离心机(上海医疗器械有限公司)。

1.2 试药

丹参药材(安徽沪春堂中药饮片有限公司);丹参素钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号111366-201305);甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂为分析纯。

1.3 丹参药材提取方法

煎煮提取法［7］:取丹参药材约50 g，精密称定，加水500 ml 煎煮，提取3 次，每次40 分钟，合并提取液浓缩至200 ml，作为煎煮法供试品溶液。

超声煎煮提取法:取丹参药材约50 g，精密称定，加入500 ml 水，分别先进行超声处理10、20、30分钟，超声功率300 W，频率40 KHz，然后采用煎煮方式，在煎煮20、40、60 分钟以及煎煮次数1、2、3 次的不同情况下进行提取，所得提取液浓缩至200 ml，离心，过滤，续滤液作为超声煎煮法供试品溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18 柱(4.6 ×250 mm);流动相:甲醇—0.5%醋酸水溶液=5∶95;流速1 ml/min;检测波长281 nm;柱温30 ℃;进样量10 μl。

1.5 对照品溶液的制备

精密称取丹参素钠2.0 mg，置10 ml 容量瓶中，加入50%甲醇，定容，得0.20 mg/ml 丹参素钠对照品溶液。

1.6 统计方法

采用Excel 软件进行线性回归、正交实验设计的统计分析。

2 结果

2.1 线性关系考察

精密吸取丹参素钠对照品溶液2、4、8、12、16 μl注入超高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积的积分值(Y)对对照品的进样量(X)制备标准曲线方程，得到标准曲线方程为Y =175.27X-22.942，r =1.0000。结果表明，丹参素钠在0.40 ～3.2 μg 范围内线性关系良好。

2.2 精密度试验

精密吸取0.20 mg/ml 丹参素钠对照品溶液10 μl 注入超高效液相色谱仪，连续进样6 次，结果显示，丹参素峰面积RSD 为1.28%，表明精密度良好。

2.3 重复性试验

精密称取同一样品6 份，按1.3 项下“煎煮提取法”制备供试品溶液，并按上述色谱条件对丹参素含量进行测定，其RSD 为0.99%，表明重复性良好。

2.4 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 小时进样，测得丹参素含量的RSD 为1.05%，表明供试品溶液在12 小时内稳定。

2.5 加样回收率试验

取已知含量的供试品6 份，精密称定，分别精密加入一定量的对照品，按1.3 项下“煎煮提取法”处理，并按上述色谱条件对丹参素含量进行测定，计算回收率，其平均值为98.12%，RSD 为3.08%。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.6 超声煎煮提取工艺最佳提取条件的考察

以丹参素提取率为考察指标，选择影响丹参素提取的主要因素超声时间(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)为考察因素，按L9(34)正交实验设计进行试验，因素水平表见表2，正交实验结果见表3，方差分析见表4。

表2 正交实验因素水平

表3 L9(34)正交实验结果

表4 方差分析

由方差分析结果显示，A，C 有显著性差异(P ＜0.05)，极差RC＞RA各因素对丹参素总量的影响依次为:C＞A＞B;同一因素的3 个水平比较得知:A3＞A1＞A2，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1。考虑到节能经济因素，故确定最优组合为A3B1C3，即超声10 分钟，煎煮20 分钟，煎煮3 次。

2.7 样品测定

取3 份样品各50 g，按2.5 项下所得超声煎煮最佳工艺提取丹参素，计算其总量，并与煎煮法供试品溶液中丹参素总量比较，结果见表5。

表5 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

流动相的选择方面，实验中作者曾考察了甲醇—水系统、乙腈—水系统和甲醇—醋酸水溶液系统作为丹参素含量测定的流动相，结果发现当以甲醇—水和乙腈—水做流动相时，各色谱峰拖尾严重，且各峰之间分离效果较差，而以甲醇—醋酸水溶液系统做流动相后，各色谱峰峰形良好且能得到良好的区分。为了改善峰形、提高分离度，调整流动相比例，最后确定使用甲醇—0.5%醋酸水溶液(5:95)作为本实验的流动相，所得丹参素峰形较好，分离度大于1.5，理论塔板数大于1500。

提取溶剂的选择方面，参照《中华人民共和国药典》(一部)(2010年版)及相关文献［7-8］中丹参素的提取方法，分别考察了30%甲醇、50%甲醇、100%甲醇等溶剂对丹参素进行提取。结果表明，用50%甲醇的提取效果较好，故本试验采用50%甲醇为提取溶剂。

样品测定结果显示，采用超声煎煮法所得丹参素的量明显多于传统煎煮法。主要原因是超声波能产生强烈振动、高加速度、强烈的空化效应和搅拌作用，可加速有效成分进入溶剂，从而有利于丹参素的提取。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国中医药出版社，2010:70.

［2］罗彩莲.丹参的药理作用与临床应用［J］.中国当代医药，2012，19(12):11-12.

［3］毕跃峰，贾陆，张小娟，等.同提取方法对丹参中丹参酮ⅡA 和丹酚酸B 含量测定的影响［J］.药物分析杂志，2009，29(7):1209-1212.

［4］樊永庆，杨济昆，刘建平，等.丹参素缓释微丸的制备及家兔体内药动学研究［J］.药学与临床研究，2013，21(2):105-108.

［5］岳喜典，王丽，曲桂武，等.非水滴定法测定丹参素钠原料药的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(15):137-139.

［6］徐飞，尹蓉莉，钟玲，等.超声提取六味地黄丸复方的工艺研究［J］.时珍国医国药，2006，17(8):1432-1434.

［7］路毅.丹参水煎煮工艺及最佳粒径研究［D］.武汉:华中科技大学，2007.

［8］魏惠珍，王跃生，吴有根，等.HPLC 同时测定冠心丹参胶囊中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的含量［J］.中成药，2009，31(1):64-68.

［9］张筱芳，王莉.HPLC 法测定养心活血片中丹参素的含量［J］.西北药学杂志，2012，27(5):409-411.