植物中RNA沉默机制的研究进展

金太成,杨丽萍，勾 畅，许亚男，郑 爽

(吉林师范大学 生命科学学院，吉林 四平 136000)

0 引言

基因沉默 (gene silencing) 现象最早是在1990年被发现的．Napoli等人为了加深矮牵牛花的颜色，在参与花青素合成过程中的关键酶—苯基乙烯酮合酶的基因前加上了一个强启动子，并转入矮牵牛花中．但是结果与预期相反，花的颜色不但没有变成深紫色，反而变浅或变成白色[1]．后来人们称这种现象为共抑制 (cosuppression)．此后，在很多植物中都发现了共抑制现象，这就是我们现在所熟知的转基因沉默现象．大量研究表明基因沉默也存在于哺乳动物中， Elbashir等实验说明了21个核苷酸的双链dsRNA可以有效地诱导培养的哺乳动物细胞的基因沉默[2]；Paddison等研究表明，小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA) 能够有效地抑制小鼠体细胞及胚胎干细胞中基因的表达[3]．越来越多的研究结果让人们逐渐认识到基因沉默是控制基因及其表达的有力工具，为研究人类基因功能和治疗人类疾病提供了基础依据．

1 植物RNA沉默

基因沉默 (gene silencing) 是指生物体中某个基因由于转录被抑制或翻译被抑制等原因而不能正常表达的现象．基因沉默主要有三种类型，一是由于DNA甲基化导致基因不能被转录，从而抑制基因的表达，被称为转录水平的基因沉默 (transcriptional gene silencing，TGS)；二是由于转录后的RNA序列被剪切导致基因表达被抑制的现象，被称为转录后水平的基因沉默 (post-transcriptional gene silencing，PTGS)；三是由于基因所在位置不同而影响基因表达的现象，被称为位置效应 (position effect)[4]．

1.1 转录水平的基因沉默(TGS)

基因及其启动子区DNA序列的高度甲基化可以导致基因发生TGS．人们现已发现TGS发生在细胞核内，siRNA在这个过程中发挥重要作用，通过DNA甲基化来阻断基因的表达．植物能够通过这种途径防御外源DNA序列和DNA病毒的入侵．例如，当DNA病毒侵染植物时，病毒的单链DNA序列在宿主特有的DNA依赖的RNA聚合酶(DNA-Dependent RNA polymerase)Pol IV 作用下，转录合成单链RNA，并在RNA依赖的RNA聚合酶 (RNA-Dependent RNA polymerase，RDR2)作用下合成双链RNA，其在Ⅲ型RNA酶Dicer(Dicer-Like，DCL3)蛋白的剪切作用下形成24nt siRNA，24nt siRNA的一条链进入ARGONAUTE4蛋白(AGO4)，并招募植物特有蛋白DNA依赖的RNA聚合酶Pol V，对其同源序列进行DNA甲基化，此过程还要求甲基化转移酶的参与[5-9]．这一过程是由RNA介导的DNA甲基化(RNA directed DNA Methylation，RdDM)[10]．RdDM途径要求24-nucleotide (nt) siRNA对三种类型的甲基化位点包括CG、CNG和CHH位点进行DNA甲基化的从头合成．DNA甲基化最终导致基因不能发生转录而抑制基因的表达．

1.2 转录后水平的基因沉默(PTGS)

植物中PTGS发生在细胞质中，同样利用siRNA特异性的识别并靶向RNA序列进行剪切或翻译抑制．小分子RNA，例如microRNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)，在其中发挥着重要作用．参与这些小分子RNA形成的主要的宿主元件包括Ⅲ型RNA酶Dicer(Dicer-Like，DCL)和包含ARGONAUTE类蛋白(AGO)的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，以及RNA依赖的RNA聚合酶RDR(RNA-dependent RNA polymerase,RDR)等作用蛋白[5]．

具体过程：第一步是双链RNA (dsRNA)的形成．dsRNA的形成是诱导转录后基因沉默即PTGS过程的一个关键环节，外源DNA序列如转基因序列的插入和外源RNA序列如RNA病毒等均可诱导宿主产生dsRNA．实验证明体外人工合成的序列互补的单链RNA或dsRNA导入体内都可诱导PTGS的发生[11]．目前已知的植物病毒基因组90%以上都是单链RNA(ssRNA)，这种基因组依靠病毒自身编码的RdRP蛋白合成dsRNA．此外，异常的单链RNA能够先通过RdRP蛋白合成dsRNA，再诱导产生PTGS效应．转座子(transposon)也可以产生dsRNA[12]．其次是siRNA的形成．现已确认Dicer蛋白是将长链dsRNA降解为siRNA的作用蛋白．小分子RNA产生的基本过程是来源不同的dsRNA进入Dicer中被剪切成21-24nt的双链小分子RNA．最后是mRNA的降解．小分子RNA的一条链进入包含AGO蛋白的RISC复合物，并引导RISC复合物结合到与小分子RNA单链相匹配的靶标RNA链上，引起目的mRNA的剪切、降解、翻译抑制或者是DNA和组蛋白的修饰[13-14]．

1.3 位置效应

位置效应是由于基因在基因组中的位置影响了基因的表达．如果外源基因整合到异染色质区域，该区域甲基化程度高、转录活性低，一般不能表达；如果外源基因整合到常染色质区域，该区域甲基化程度低、转录活性高，则有利于基因的表达．目前，外源基因的遗传转化方法是将外源基因随机整合在宿主的基因组中，因此，基因的插入位点、序列的甲基化程度高低和转录是否活跃就决定了外源基因能否稳定的表达．外源基因插入位点形成宿主易于识别的甲基化位点，就会导致其在甲基化酶的作用下发生甲基化而失活．

2 RNA沉默的主要功能

RNA沉默能够引起基因表达的阻断，并参与抗病毒和环境胁迫反应．2008年，Bisaro实验室使用CaLCuV和BCTV侵染一系列包括胞嘧啶甲基转移酶、组蛋白H3K9甲基转移酶、siRNA介导的甲基化途径相关的突变体发现甲基化缺陷的一系列突变体以及ADK突变体对双生病毒侵染的敏感性都增加了，症状更加明显．同时，他们通过亚硫酸氢盐测序法检测了双生病毒侵染的拟南芥，发现双生病毒基因组DNA的一些潜在的甲基化位点确实被甲基化了，而L2突变的双生病毒的甲基化程度，特别是非对称型的CHH甲基化水平相应的提高，并且该高度甲基化表型需要AGO4的参与[15]．最近，他们进一步的研究发现，AL2和L2能够抑制GFP转基因的TGS，还能造成植物宿主基因组中高度重复序列甲基化程度降低，进一步说明AL2和L2能够通过抑制ADK的活性抑制植物宿主siRNA介导的甲基化途径[16]． 植物通过siRNA介导的RdDM对转座子，重复序列等内源DNA序列进行甲基化从而抑制其基因的表达．同样的可以利用RdDM防御外源DNA序列(包括各种RNA病毒和DNA病毒)的入侵，这被认为是植物维持基因组稳定性的保护机制．

3 DNA病毒编码的基因沉默抑制子的功能

植物既可以通过RdDM途径防御外源DNA序列的入侵，也能够通过RdDM途径抑制病毒的侵染和复制．而病毒在长期的进化过程中利用自身编码的蛋白与宿主的防御途径中的蛋白进行互作，并通过抑制某些效应蛋白来对抗宿主的防御机制，最终达到病毒自身能够在宿主植物中进行复制，积累的目的．自从发现第一个由植物病毒编码的基因沉默抑制子HC-Pro以来，现在已经发现了40多个基因沉默抑制子．国内外多项研究表明，病毒编码的沉默抑制子通过和宿主内源的蛋白互作，来抑制宿主对病毒的转录基因沉默反应．例如，AL2/AC2或L2/C2是双生病毒反义链编码的一个蛋白，被认为参与了植物基因沉默相关的抗病毒防御反应[17-18]．他们的研究还发现TGMV AL2和BCTV L2能够抑制SNF1和ADK2 的活性，其研究表明，AL2/L2蛋白可能通过调节植物代谢过程和影响转甲基化循环来对抗宿主的沉默反应[19-20]．

4 展望

关于植物RNA沉默机制、病毒基因沉默抑制子的功能，以及植物病毒与宿主的互作机制等研究越来越深入，我们对这些科学问题的认识也日益清晰．RNA沉默存在于植物等大多数真核生物中，能够引起基因表达的阻断，参与调控基因表达、抗病毒和环境胁迫反应等诸多过程[21-23]．基因沉默抑制子的发现不仅为研究基因沉默机制提供了一个切入点，而且为人们对植物的防御机制的深入研究提供了有力证据．人们对RNA沉默机制的了解更加有利于我们对真核生物基因表达及其调控的理解，而且对这些科学问题的认识将为今后的抗病毒育种工作带来新的启迪．

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