45例胸腔积液细胞蜡块结合免疫组化在细胞学诊断中的应用

沈湘萍陈 艳

（1．东阳市红十字会医院，浙江东阳 322100；2．东阳市人民医院，浙江东阳 322100）

45例胸腔积液细胞蜡块结合免疫组化在细胞学诊断中的应用

沈湘萍1陈 艳2

（1．东阳市红十字会医院，浙江东阳 322100；2．东阳市人民医院，浙江东阳 322100）

目的探讨胸腔积液细胞蜡块技术结合免疫组化在细胞学诊断中的意义。方法对45例疑似恶性胸腔积液标本进行制作细胞蜡块切片HE染色及免疫组化染色，对疑似恶性胸腔积液标本进行明确诊断及判断组织来源。结果依据切片组织形态学特征和免疫标记结果分析，45份疑似恶性胸腔积液标本中发现肺小细胞癌5例，鳞状细胞癌8例，腺癌22例，恶性淋巴瘤1例，恶性间皮瘤1例，印戒细胞癌1例，余除外恶性肿瘤细胞7例。结论胸腔积液沉渣包埋切片及免疫组织化学可作为恶性胸腔积液诊断的重要手段，并可为临床寻找和判断恶性肿瘤细胞组织来源提供帮助。

细胞蜡块；免疫组化；胸腔积液

尽管多数胸腔积液病例凭传统涂片常规染色能判断良恶性，但缺乏纯客观指标，有时难以鉴别瘤细胞与增生的间皮细胞，且不能判断瘤细胞的组织起源，还可能因为标本量少、含血、胶冻状标本导致具有诊断意义的细胞量少或细胞变形难以确认而误诊。因此，仅凭常规涂片镜下结果选择治疗方案风险过高。本文通过观察胸腔积液离心沉渣涂片、细胞蜡块切片的细胞学形态，结合多项细胞蜡块切片免疫组织化学染色检查，旨在更客观地判断胸腔积液细胞的良恶性及瘤细胞的组织来源。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集东阳市人民医院和东阳市红十会医院2010年1月～2013年6月细胞病理资料。纳入标准：送检标本均为患者入院第2天清晨收集的新鲜胸腔积液420例，应用常规细胞学涂片筛查选择疑似恶性胸腔积液45例，利用剩余标本进行制作细胞块。其中男32例，女13例；年龄27～90岁，平均（45±8.1）岁。

1.2 常规细胞涂片 患者入院第2天清晨收集新鲜的胸腔积液标本100 mL以上，静置于阴凉处5分钟，将50mL左右的自然沉淀标本分别置于两个容量为50mL塑料离心管中。平衡后以3000转／min的速度离心10分钟左右，轻轻取出离心管至污水池中将离心管底朝上彻底倒去上清液。采用镊子夹脱脂干棉球或一小块海棉（最好是棉球）沾取沉淀物，在玻片上轻轻印片，稍置片刻，潮干情况下置95%乙醇固定液中2小时以上，进行染色。涂片由两位高年资细胞病理医师进行形态学观察，根据细胞形态、核不典型性和粘附性分为良性、恶性。（1）良性：反应性增生间皮细胞（细胞弥散、形态温和、无不典型性）；（2）恶性：小细胞癌、恶性间皮瘤、恶性淋巴瘤、鳞状细胞癌、腺癌和印戒细胞癌等其它恶性肿瘤。

1.3 细胞块制作 选择常规细胞涂片疑似恶性胸腔积液标本45例，将常规细胞学检查剩余的细胞学标本移入20～50mL离心管，3000转／min，离心10分钟，离心沉渣较少者移出上清液，重复加入细胞学标本并离心，直到离心沉渣满足要求。离心管内保留上清液1.5～2.5 mL，轻轻混匀，移入专用离心管，色泽较浅的标本可适当滴加伊红试剂染色，静置10分钟后，放入水平式离心机1500转／min，离心5分钟（血性细胞学标本，去除红细胞后的离心沉渣仍含有较多血红蛋白，需将离心时间延长1倍，有时红细胞碎片堵塞滤过膜，可以出现液体无法全部滤除现象，此时取下收集环，使用滤纸吸取多余水分后，一般不影响细胞块制作）；取出细胞块收集环，细胞混悬液中的细胞成分被收集至细胞块收集环中，形成固定大小形状的固体细胞块，从上部滴加l～2滴琼脂液（已加热至50～60℃），室温冷却，连同收集环用脱水纸包裹后放入脱水盒，4%中性甲醛固定液固定6～8小时以上，即可进入脱水机常规脱水处理，常规脱水、透明、浸蜡后包埋，切片行HE染色。采用EnVision两步法，所用抗体CK7、CK20、CDX2、CD68、LCA、P63、CEA、TTF－1、SYN、CGA、CD56、CK5／6、Calretinin、HBME－1和VIM均为工作液，均购自上海基因科技有限公司，染色过程按说明书进行，用DAB显色，每批染色以PBS代替一抗设立空白对照，染色切片中采用已知阳性组织，同时染色设立阳性对照。

1.4 免疫组化评定 根据染色程度和染色细胞百分率进行评定和分析。综合考虑阳性细胞数和染色强度来判定结果：计算阳性细胞百分数并赋予分值：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，5l%～75%为3分，＞75%为4分；观察着色强度并赋予对应分值，无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两者相乘，0分为（－），1～4分为（＋），5～8分为（＋＋），9～12分为（＋＋＋）。将（－）归为阴性表达，（＋）～（＋＋＋）归为阳性表达［1］。每批染色以PBS代替一抗设立空白对照，染色切片中采用已知阳性组织，同时染色设立阳性对照。

2 结 果

2.1 HE染色镜下观察 恶性胸腔积液存在同一类形态特征和组织结构形成趋势的异型细胞，与间皮细胞、吞噬细胞相比具有不同的感觉，表现在涂片中：（1）细胞明显异型，多形性，核质比高，核膜厚、不规则，核深染，染色质粗糙，核仁大；（2）立体感强（具明显的三维结构），即使是单个癌细胞也有“厚实”感，癌细胞团常看不清结构；（3）形成结构，即使是分化差、细胞散在分布为主的病例，也总能找到少量网状、链珠状（细胞间只有少量胞膜相连）、竹节状（细胞侧面紧密连接形成细胞条索）、花结、桑椹状、球团－团块、梁索、乳头状的细胞组合，细胞排列紧密、无序，表面具张力感（局部呈弧形轮廓）。细胞蜡块切片中可见中空的腺样、囊泡状、梁索－乳头状或片状排列的细胞。间皮细胞、吞噬细胞不很均匀，但不具备真正的异型性，它们常平铺或散在，连接松散，细胞块切片边缘破碎不整；间皮细胞偶可形成小球团，但胞核可辨。淋巴瘤积液中的瘤细胞较单一，胞质少或裸核，排列松散。小细胞癌细胞大小约为正常间皮大小，约为成熟淋巴细胞的2倍大小，细胞分布疏松、不规则，细胞之间相互挤压、嵌套。细胞核质比高，胞浆少，细胞核深染，可见核内有分布较为均匀的细小的染色质颗粒，无或仅有小的核仁，可见分裂象及坏死。

2.2 免疫表型 综合HE染色的细胞学涂片、细胞块切片及临床资料，不同的病例选用不同的抗体，因此每类抗体所染的例数各不相同，见表1。细胞块切片免疫细胞化学染色定位准确、颗粒清晰（见第308页彩图2）。

表1 细胞蜡块免疫组化结果（%）

3 讨 论

恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液。目前国内外尚缺乏MPE流行病学的调查研究资料，据统计，美国每年MPE的发病人数超过150000人。几乎所有的恶性肿瘤均可出现MPE。肺癌是最常见的病因，约占MPE的1／3，乳腺癌次之，淋巴瘤也是导致出现MPE的重要原因，卵巢癌和胃肠道癌出现MPE者也不少见，5%～10%的MPE找不到原发肿瘤病灶。胸水常规涂片检查具有简便、快速、易行等优点，是目前大部分基层医院病理科胸腔积液细胞学检查的首选方法，但常规涂片阳性率普遍偏低，原因在于常有大量红细胞、炎性渗出物及黏液混杂在一起，造成背景不清晰，同时细胞厚薄不均匀，细胞多层重叠较为严重，有些阳性细胞甚至被干扰物所覆盖，并且结构不清，面积大而敏感度较低，导致癌细胞的检出出现假阴性及假阳性。涂片上肿瘤细胞量一般较少且不适用于后期的免疫组化，给肿瘤疾病的诊断、鉴别诊断和判断肿瘤来源带来了很大的困难。细胞蜡块技术制作简单且可避免常规细胞涂片的不足，蜡块又可以像常规活检组织块一样反复间断切片，有利于多种抗体联合运用或对某一特定细胞进行比较观察，阳性颗粒为棕黄色或棕褐色，定位准确可靠、背景清晰、提高了阳性率，对胸腔积液的诊断、鉴别诊断及判断组织来源提供可靠的依据。本文45例利用常规涂片筛查的疑似MPE标本，经过细胞蜡块免疫组化最后确诊MPE 38例，常规涂片假阳性率15.6%，与文献报道相近［2－3］。38例MPE中，利用细胞蜡块免疫组化确诊组织来源肺癌占绝大多数，淋巴瘤、胃肠道癌及间皮病变等也不罕见。38例MPE细胞蜡块结果提示免疫组化抗体表达特异性及敏感性并非100%，且间皮细胞具有双向分化，可以表达上皮、间叶等多种标记物，因此在选择免疫组化抗体时，应结合临床病史及HE染色镜下形态特点尽可能选择多个组合，如小细胞癌选择CGA、SYN、CD56、TTF1和CK等［4－5］，鳞状细胞癌选择CK5／6、P63等组合，恶性淋巴瘤选择LCA、CD20、CD79a、CD3、CD43等组合［6］，肺腺癌选择CEA、CK7、TTF1等组合［7］，乳腺癌选择GCDFP－15、ER和PR等组合，胃肠道癌选择CK20和CDX2等组合，间皮病变选择Calretinin、HBME－1和Vim等组合［8－9］。

总之，细胞常规涂片仅依赖细胞形态学进行病理诊断，难以确定异型细胞类型、性质及其来源，细胞蜡块的免疫标记更具优势，不仅有助于细胞病理学阳性检出率的提高，而且有利于恶性肿瘤细胞的鉴别诊断及其组织器官来源的分析判断。

［1］Howard H Wu，Kelly J Jones，Harvey M Cramer．Immunocytochemistry performed on the cell－transferred direct smears of the fine－needle aspirates：a comparison study with the corresponding formalin－fixed paraffin－embedded tissue．American journal of clinical pathology，2013，139（6）：754

［2］Bhatia P，Dey P，Uppal R，et al．Cell blocks from scraping of cytology smear：comparison with conventional cell block．Acta Cytologica，2008，52（3）：329

［3］Meenu Thapar，Rajiv K Mishra，Amit Sharma，et al．Critical analysis of cell block versus smear examination in effusions．Journal of cytology／Indian Academy of Cytologists，2009，26（2）：60

［4］岑玉兰，金克群．30例肺低分化神经内泌癌的细胞学诊断及鉴别诊断．检验医学与临床，2010，7（15）：1612

［5］虞红珍，吴强，秦蓉，等．联合组织学与细胞学对肺低分化神经内泌癌的诊断和鉴别诊断．临床与实验病理学杂志，2012，28（1）：61

［6］周小鸽．淋巴瘤病理诊断中的抗体选择．诊断病理学杂志，2010，17（1）：4

［7］陈江帆，杜明伟，姜海娇，等．免疫细胞化学方法对胸腔积液中恶性肿瘤细胞的分类与诊断．中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（1）：49

［8］Ascoli V，Bosco D，Carnovale Scalzo C．Cytologic re－evaluation of negative effusions from patients with malignant mesothelioma．Pathologica，2011，103（6）：318

［9］Seiki Hasegawa，Nobuyuki Kondo，Seiji Matsumoto，et al．Practical approaches to diagnose and treat for T0 malignant pleural mesothelioma：a proposal for diagnostic total parietal pleurectomy．International journal of clinical oncology ，2012，17（1）：33