Ets－1和MMP－9对淋巴瘤侵袭转移和预后的预测价值

牟 虹 范京京 陈美莲

（淳安县第一人民医院，浙江淳安 311700）

Ets－1和MMP－9对淋巴瘤侵袭转移和预后的预测价值

牟 虹 范京京 陈美莲

（淳安县第一人民医院，浙江淳安 311700）

目的评估免疫组织化学S－P法对E26转录因子－1（Ets－1）和基质金属蛋白酶－9（MMP－9）检测用于预测淋巴瘤侵袭性以及评估预后的临床意义。方法150例淋巴瘤病患者取其淋巴瘤手术标本分为侵袭组83例和非侵袭组67例，另选择20例良性增生性的淋巴结炎作为对照组，通过免疫组化S－P方法对Ets－1和MMP－9蛋白表达情况进行检测，并分析Ets－1和MMP－9在不同临床和病理特征中的表达。结果（1）Ets－1和MMP－9在淋巴瘤组的表达均高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.01）。（2）MMP－9的表达和患者的年龄、性别以及组织学类型没有显著关系；而MMP－9在侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率（80.7%）显著高于非侵袭性淋巴瘤组织（38.8%）（P＜0.01）；在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的阳性率（72.0%）显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者（52.0%）（P＜0.05）；Ets－1的表达和患者的年龄以及组织学类型无显著关系；Ets－1在女性中的阳性表达率（71.7%）显著高于男性（36.1%）（P＜0.01），在侵袭性淋巴瘤组织中（62.7%）显著高于非侵袭性淋巴瘤组织（31.3%）（P＜0.01）；在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的阳性率（82.7%）显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者（41.3%）（P＜0.05）；（3）Ets－1和MMP－9两者弱相关（r＝0.319）。结论Ets－1和MMP－9在淋巴瘤的侵袭性判断以及预后评估方面是比较可靠的生物学指标。

Ets－1；MMP－9；免疫组织化学；侵袭性；预后

单核苷酸的多态性（single nucleotidepolym orphism，SNP）指的是在基因组内某一特定位置上的核苷酸出现了碱基的改变，而发生改变的基因型在整个族群中出现的频率需在1%以上，这是人类基因组的主要变异形式，对肿瘤的治疗效果以及易感性会造成影响［1］。近年来，基质金属的蛋白酶类基因逐渐成为热点研究对象，是遗传中的一组重要候选基因。基质金属蛋白酶（matrimetall oproteinases，MMPs）可将细胞外的各基质组分进行切断，例如蛋白聚糖、纤维性结合蛋白、层黏连蛋白和胶原蛋白等，密切相关于恶性肿瘤发展、转移和侵袭。MMP－9是降解基底膜以及细胞外部基质的关键性蛋白酶，在众多恶性肿瘤当中均有表达上升的情况。而Ets－1为Ets转录因子的家族成员之一，Ets－1基因编码的Ets－1蛋白分子量是54kD，其通过结合MMPs启动子的增强区域内的特定DNA序列而达到对其转录以及表达的调控作用，从而参与到血管生成、细胞增殖等多种生理进程［2］。本研究通过免疫组织化学S－P法对Ets－1和MMP－9检测用于预测淋巴瘤侵袭性，以及评估预后的临床价值进行探讨，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 淋巴瘤组标本取自本院2013年5月～2014年5月150例淋巴瘤患者，其中男97例，女53例，年龄11～79岁，平均（51.3±2.5）岁。按照Ann Arbor分期原则分为Ⅰ期48例，Ⅱ期27例，Ⅲ期45例，Ⅳ期30例。通过免疫学检查可分为T细胞淋巴瘤55例，B细胞淋巴瘤87例，霍奇金淋巴瘤8例。根据《欧洲－美国淋巴组织肿瘤分类方法》侵袭性的判断标准［3］分为侵袭组83例，非侵袭组67例。另取同时期20例良性增生性的淋巴结炎作为对照组，其中男13例，女7例，年龄15～73岁，平均（45.5±6.2）岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 标本处理：将手术获取的组织一部分放入甲醛溶液进行固定，在脱水后使用石蜡进行包埋，剩余部分使用生理盐水将积血洗净，并立刻置于由焦碳酸二乙酯处理后的冻存管，充入液氮留作备用。检测试剂：兔抗人MMP－9多克隆抗体购自上海领成生物科技有限公司；鼠抗人Est－1单克隆抗体购自上海信则生物科技有限公司；DAB显色剂以及SP试剂盒购自北京北瑞达医药科技有限公司。免疫组化S－P检测：将石蜡包埋的组织标本做5μm的连续切片，其中一张用于HE染色以对病理结果进行进一步确认，免疫组化操作严格按照试剂盒说明书进行。使用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 判定标准［4］Ets－1和MMP－9免疫组织化学检测结果判定标准：镜下对血管内皮细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和淋巴细胞进行观察。光镜下对组织切片显色情况进行观察，每例随机选择4个高倍镜的视野。Ets－1和MMP－9的阳性标准均为胞浆中有棕黄色的颗粒出现，阴性标准均为没有出现。Ets－1的主要表达位点是淋巴瘤细胞，MMP－9不仅在肿瘤细胞中表达，还可于间质的巨噬细胞、纤维母细胞以及新生的血管内皮细胞中表达。按照阳性细胞所占比例以及阳性反应程度打分，可分为：（1）阳性细胞：＞75%记4分，＞50%～75%记3分，＞25%～50%记2分，5%～25%记1分，＜5%记0分；（2）阳性反应程度：棕黄色记3分，黄色记2分，淡黄色记1分，没有着色记0分；阳性细胞所占比例和染色强度的乘积在10～12分记（＋＋＋），7～9分记（＋＋），2～6分记（＋），＜2分记（－）。阳性表达包括（＋）、（＋＋）和（＋＋＋），阴性表达为（－）。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计分析软件，计数资料采用χ2检验，线性相关分析采用Sperman分析。

2 结 果

2.1 MMP－9与Ets－1的表达 MMP－9和Ets－1在淋巴瘤组的表达均高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.01）。详见表1。

表1 两组MMP－9和Ets－1的表达情况（%）

2.2 MMP－9、Ets－1与患者基本特征及淋巴瘤侵袭性的关系 MMP－9的表达和患者的年龄、性别以及组织学类型没有显著关系；而MMP－9在侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为80.7%，在非侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为38.8%，差异具有统计学意义（P＜0.01）；MMP－9在Ⅰ期和Ⅱ期患者中的阳性率为52.0%，在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的阳性率为72.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）。Ets－1的表达和患者的年龄以及组织学类型无显著性关系；Ets－1在女性阳性率为71.7%，男性阳性率为36.1%，两者差异具有统计学意义（P＜0.01）；Ets－1在侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为62.7%，在非侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为31.3%，差异有统计学意义（P＜0.01）；Est－1在Ⅰ～Ⅱ期患者中的阳性率为41.3%，在Ⅲ～Ⅳ期患者中的阳性率为82.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 MMP－9与Ets－1的表达与患者基本特征及病理学特征的关系

2.3 Ets－1和MMP－9的相关性 150例接受检测的淋巴瘤组织当中，57例为Ets－1和MMP－9均表达为阳性；42例为Ets－1和MMP－9均表达为阴性；35例为Ets－1表达阴性而MMP－9表达阳性；16例为Ets－1表达阳性而MMP－9表达阴性。通过Sperman进行相关分析，r＝0.319，Ets－1和MMP－9两者呈弱相关。

3 讨 论

恶性肿瘤的转移与侵袭是最基本的病理特征，也是影响患者预后的主要因素，而淋巴瘤在病变发展过程中常在多个器官以及淋巴结区出现转移和侵袭［5］。因此，对淋巴结是否存在侵袭转移的正确判断对临床治疗及预后非常重要。

MMPs为依赖锌离子并高度保守的酶家族，主要功效是水解内切蛋白，可以对细胞外部基质以及基底膜的大部分蛋白质进行降解。近年研究显示［6］，MMP－9为肿瘤细胞以及周围的基质细胞所分泌，其对于肿瘤侵袭、转移灶生成以及肿瘤血管化均产生了重要影响。MMP－9主要与生理pH下，通过锌离子的作用，参与到降解和重建胞外基质的进程。有研究表明，肿瘤的转移侵袭相关潜能和肿瘤细胞分泌MMP－9蛋白能力为正性相关，MMP－9不仅参与到胞外基质降解，同时也会影响肿瘤细胞能动和粘附能力。结肠癌、乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤组织中MMP－9的表达都有显著升高。已有研究表明［7］，MMP－9在非霍奇金淋巴瘤组织中阳性率为84.3%，显著高于良性的增生淋巴结炎组织，且Ⅲ～Ⅳ期患者阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者，提示其可能是非霍奇金淋巴瘤预后以及转移侵袭预测的有关因素。本研究中MMP－9在淋巴瘤组织中（淋巴瘤组）的阳性率为62.0%，显著高于对照组的20.0%，此外，MMP－9在侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为80.7%，在非侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为38.8%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

Ets－1基因为原型Ets基因，具有多个结构功能区域，其中处于羧基末端的即为Ets结构区域，分子中央位置为反式激活的结构区域，两侧位置是抑制结构区域，对Ets－1同DNA的结合进行负性调节。胚胎发育过程中结缔组织的重塑、新生血管的形成、神经嵴的迁移、器官形成和组织塑形等环节均有Ets－1的参与。成人的Ets－1主要优势表达于淋巴细胞。目前通过多种检验方法发现众多恶性侵袭性的肿瘤中出现Ets－1再次表达［8］。本研究结果显示，Ets－1在淋巴瘤组织中（淋巴瘤组）的阳性率为48.7%，显著高于对照组中的15.0%，且男性患者的Ets－1阳性率（36.1%）远低于女性患者（71.7%），两者差异具有统计学意义（P＜0.01）；Ets－1在侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为62.7%，在非侵袭性淋巴瘤组织中的阳性率为31.3%，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示Ets－1对淋巴瘤的侵袭转移以及预后也具有一定的预测作用。

Ets－1通过结合MMPs启动子的增强区域内的特定DNA序列而达到对其转录以及表达的调控作用，从而参与到血管生成、细胞增殖等多种生理进程。本研究显示，Ets－1和MMP－9表达的相关系数r＝0.319，具有弱相关性，是否提示淋巴瘤组织中MMP－9表达水平的调控还可能有其它因子的参与［9］，有待进一步研究。

综上所述，在淋巴瘤的侵袭性判断以及预后评估方面，Ets－1和MMP－9是比较可靠的生物学指标。

［1］ 冯永怀，吴柳松，苏俊，等．MMP－26，TIMP－4和MMP－9在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及意义．中国实验血液学杂志，2013，21（5）：1167

［2］ 王瑞芬，黄坊，孙和国，等．α－SMA和MMP－9在乳腺癌中的表达及意义．诊断病理学杂志，2013，20（2）：91

［3］ 张爽，农琳，张莹，等．自然杀伤（NK）细胞发育相关转录因子在结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中的表达及意义．中华病理学杂志，2010，39（6）：366

［4］ Vu T H，Werb Z．Matrix metalloproteinases：effectors of development and normal physiology．Genes Dev，2000，14（17）：2123

［5］ 涂金花，姚丽青，余英豪．原发性中枢神经系统弥漫大B细胞性淋巴瘤16例临床病理分析．临床与实验病理学杂志，2011，27（10）：1059

［6］ 吴肖志军，王华，王科峰，等．GELOX与EPOCH方案化疗序贯放疗一线治疗ⅠE／ⅡE期结外NK／T细胞淋巴瘤的疗效比较．广东医学，2013，34（6）：864

［7］ ZHENG J，HONG Z．Relationship between gene positioning and chromosomal translocation in cancer．TUMOR，2012，32（6）：475

［8］ 赵文娣，吴继锋，张红，等．转录因子Ets－1与MMP－9在胃癌中的表达及临床意义．中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19（2）：176

［9］ 张明明，徐玉清．MMP－2和MMP－9在恶性肿瘤中的研究进展．国际肿瘤学杂志，2012，39（11）：820