肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达及意义

王细勇 杜开齐 张志豪 朱有才

（中国人民武装警察部队浙江省武警总队医院，浙江嘉兴 314000）

·临床研究·

肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达及意义

王细勇 杜开齐 张志豪 朱有才

（中国人民武装警察部队浙江省武警总队医院，浙江嘉兴 314000）

目的检测TLR4 mRNA在非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞中的表达，探讨其临床意义。方法应用RTPCR方法检测TLR4 mRNA在100例非小细胞肺癌患者和60例体检健康者外周血单个核细胞中的表达，分析TLR4 mRNA在肺癌患者及体检健康者外周血单个核细胞的表达差异及TLR4 mRNA在肺癌患者外周血单个核细胞的表达与临床病理特征的关系。结果非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达显著高于体检健康者（P＜0.05）；肿瘤最长径＞5cm的肺癌患者的TLR4 mRNA表达量高于最长径≤5cm的肺癌患者（P＜0.05）；有淋巴结转移的肺癌患者的TLR4 mRNA表达量高于无淋巴结转移的肺癌患者（P＜0.05）；TNM分期Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期、Ⅳ期肺癌患者的TLR4 mRNA表达量依次升高，两两比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。TLR4 mRNA表达量与非小细胞肺癌患者的性别、年龄、组织学类型、肿瘤分化程度及吸烟史均无关（均P＞0.05）。多元线性回归分析发现，肿瘤TNM分期是非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达的独立相关因素（P＜0.05）。结论非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达增高，且TLR4 mRNA表达与肿瘤发生、发展密切相关，可作为预测肿瘤进展的重要指标，并提示运用TLR4的相关拮抗剂如Eritoran，作为免疫佐剂用于非小细胞肺癌治疗成为可能。

非小细胞肺癌；TLR4；逆转录；PCR

肺癌是一种非免疫原性的肿瘤，可以逃逸免疫系统监控。Toll样受体4（Toll－like receptor 4，TLR4）是连接固有免疫及适应性免疫的重要桥梁，表达于多种免疫细胞［1］。研究表明，肺癌树突状细胞（DCs）、巨噬细胞及基质细胞均有TLR4的活化［2］，但肺癌患者外周血单个核细胞TLR4的表达及其与临床病理特点的关系，在国内外鲜有报道。本研究对非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达进行检测，观察其表达变化并探讨其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2012年1月～2013年12月浙江省武警总队医院收治的肺癌患者100例，经手术或活检病理检查确诊为非小细胞肺癌，并在入组前未经过放化疗及免疫治疗。100例中男67例，女

33例。年龄35～79岁，平均（59.5±11.3）岁。肺腺癌41例，鳞状细胞癌59例。高分化癌19例，中分化癌54例，低分化癌27例。有淋巴结转移者62例，无淋巴结转移者38例。吸烟者57例，非吸烟者43例；TNM分期根据2009年国际抗癌联盟（International Union Against Cancer，UICC）分期标准进行，其中Ⅰ期21例，Ⅱ～Ⅲ期47例，Ⅳ期32例。选择同期本院体检中心的体检健康者60例作为对照组，其中男30例，女30例，年龄34～77岁，平均（58.2± 11.9）岁。

1.2 主要试剂 淋巴细胞分离液购自北京赛驰生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及DNA ladder均购自TAKARA公司；TaqDNA聚合酶，dNTP均购自天为时代公司；TLR4（622 bp）上游引物：5′－CTGCAATGGATCAAGGACCA－3，下游引物：5′－TCCCACTCCAGGTAAGTGTT－3′；β－actin（374bp）上游引物：5′－CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC－3′，下游引物：5′－CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT－3′。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 单个核细胞分离 无菌条件下取试验者外周血5mL，以终浓度为50g／L的肝素抗凝。沿管壁缓慢加入含5mL淋巴细胞分离液（比重为l.077）至无菌试管中使两液面间保持清晰界面。离心20分钟（2000转／min），吸取血浆和分离液之间的单个核细胞层入另一无菌试管中，加5倍PBS液混匀，离心5分钟（1000转／min），去上清液，沉淀即为单个核细胞。

1.4 RT－PCR检测TLR4 mRNA的表达 按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，进行紫外定量，并鉴定RNA的质量。按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。25μL PCR体系，β－actin为内参。扩增参数：94℃5分钟；再以94℃40秒、50℃40秒、72℃90秒为1个循环，共30个循环；72℃5分钟。PCR产物在含有goldview的1.5%琼脂糖凝胶上95V恒压电泳35分钟，最后置于凝胶成像分析仪观察结果，TLR4 mRNA和β－actin均能扩增成功。

1.5 计算机图像处理 RT－PCR用bandscan4.3，对每个目的条带进行总光密度值的分析，以目的产物条带OD值与β－actin产物条带的OD值的比值，代表目的基因mRNA表达的相对水平。

1.6 统计学处理 所有的结果用SPSS19.0分析。两样本均数间的比较首先运用Levene检验进行两样本方差的齐性检验，如两样本方差相等，则采用两独立样本均数的t检验，如两样本方差不等，则采用近似t检验；多样本均数间的比较采用方差分析，运用Levene检验进行多样本方差的齐性检验，如方差相等，则运用Student－Newman－Keuls进行两两比较，如方差不等，则运用Dunnett T3进行两两比较。采用多元线性回归进行多因素分析。

2 结 果

2.1 TLR4 mRNA在非小细胞肺癌患者和体检健康者中的表达 非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达相对量为（0.51±0.16），体检健康者外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达相对量为（0.33±0.12）。非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达量显著高于体检健康者，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 TLR4 mRNA的表达与临床特征的关系 肿瘤最长径＞5cm的肺癌患者TLR4 mRNA表达量高于最长径≤5cm的肺癌患者，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）；有淋巴结转移的肺癌患者TLR4 mRNA表达量高于无淋巴结转移的肺癌患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）；TNM分期I期、II～III期、IV期肺癌患者的TLR4 mRNA表达量依次升高，两两比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。TLR4 mRNA表达量与非小细胞肺癌患者的性别、年龄、组织病理学类型、肿瘤分化程度及吸烟史均无关（均P＞0.05）。详见表1。

图1 TLR4 mRNA在非小细胞肺癌患者和健康体检者外周血单个核细胞表达

表1 TLR4 mRNA 的表达与非小细胞肺癌临床特征的关系

2.3 TLR4 mRNA表达的多因素分析 将单因素分析具有统计学意义的因素（肿瘤长径、淋巴结转移、TNM分期）进行多元线性回归分析（直接进入法）。统计学分析结果如下：（1）方差分析：F＝17.253，P＜0.05，表示多元线性回归具有统计学意义；（2）拟合优度：R2＝0.35，表示自变量可以解释因变量变化的35%；（3）各自变量偏回归系数的显著性检验说明TLR4 mRNA在非小细胞肺癌患者的表达只和肿瘤TNM分级存在显著线性关系，而与肿瘤长径、淋巴结转移不存在显著线性关系。建立的多元回归方程为Y＝0.373＋0.047X1＋0.106X2＋0.032X3，详见表2。

表2 各自变量偏回归系数的显著性检验

3 讨 论

Toll样受体是最具特征性的模式识别受体，目前至少发现了13种TLRs，其中最重要、研究最成熟的是TLR4。TLR4能识别病原相关分子模式（如LPS）及损伤相关分子模式（如HMGB1），在参与固有免疫［3］及适应性免疫的细胞［4］中都有不同程度的表达。TLR4与相关配体结合后，可启动两条截然不同的信号通路，一条为髓样分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）依赖的信号传导通路，最终导致前炎性细胞因子的表达；另一条为MyD88非依赖的信号传导通路，从而促进抗细菌、抗病毒及抗肿瘤免疫［5］。

肿瘤的发生发展与机体免疫功能下降及免疫监视作用的减弱密切相关，鉴于TLR4在免疫功能的重要作用，本文观察了肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达及其与临床病理特点的关系。本研究表明，非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达显著高于体检健康者。Pries等［6］发现，肿瘤细胞能调节不同免疫细胞TLR4蛋白的表达和功能，而在头颈部鳞状细胞癌患者，肿瘤免疫抑制可能与T－reg的TLR4受体激活有关［7］，因此推测在非小细胞肺癌患者肺癌细胞能通过分泌细胞因子或其他方式促进免疫细胞表达TLR4。本研究还发现TLR4 mRNA的表达与肿瘤长径、淋巴结的转移及TNM分期有关，说明肺癌患者TLR4 mRNA的上调与肿瘤发生、发展密切相关，这与Ono等［8］在胃肠癌、黄金等［9］在86例不同癌症患者及蔡智慧等［10］在肺癌的研究结果相一致，以上研究均发现肿瘤进展期患者外周血单核细胞TLR4表达水平增高。TLR4可能通过以下机制促进肺癌的进展：（1）TLR4活化可激活JNK、p38－MAPK和NF－κB通路，从而诱导IL－6、IL－10和TNF的分泌，从多方面抑制B细胞的功能［11］；（2）TLR4的激活可增强Treg细胞的抑制活性［12］；（3）TLR4可通过识别肿瘤源性HMGB1激活树突状细胞（DC）［13］，而DC细胞可通过分泌IL－27使Treg细胞增殖；（4）TLR4的激活可促进免疫细胞分泌炎性因子，形成潜在的慢性炎症，从而促进肿瘤的发生发展。本研究还通过多元线性回归分析发现，肿瘤TNM分级是非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA表达的独立相关因素，但拟合优度不高，仅能解释TLR4 mRNA表达的35%，说明尚有其它因素（如患者的基础免疫水平等）与TLR4 mRNA的表达有关，具体因素还有待进一步研究。

综上所述，本研究发现肺癌患者外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达与肺癌的发生、发展有关，提示外周血TLR4 mRNA的表达可作为预测肺癌进展及预后的新参数，TLR4的相关拮抗剂如Eritoran可望作为免疫佐剂用于非小细胞肺癌的治疗。

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嘉兴市科技计划项目（2012AY1078－4）