静水压法人工诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体的探索＊

2014-04-17刘金相王旭波刘聪辉高金宁王忠凯王文基王志刚于海洋张全启

中国海洋大学学报（自然科学版） 2014年2期

刘金相，王旭波，刘聪辉，高金宁，王忠凯，王文基，王志刚，于海洋，齐洁，张全启

（中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东青岛266003）

鲆鲽是著名的海水经济鱼类，其肉质细嫩、营养丰富、味道鲜美，深受消费者欢迎，是我国海水鱼类养殖的主导产品之一。近年来，随着鲆鲽的养殖规模不断扩大，苗种需求量逐年增加。而国内大部分养殖基地亲本更换率过低，繁育群体过小，逐渐造成近交积累，导致鲆鲽养殖群体的遗传多样性降低，主要表现为生长速度缓慢、对病害和恶劣环境的耐受能力下降等。杂交育种可以产生优良性状、增加变异性、丰富遗传结构，出现新的遗传特性。

鱼类的杂交优势在国内外已有很多成功的范例，Stevens等[1]用条纹鲈（Moronesaxatilis）和白鲈（Lateolabraxjaponicus）杂交，得到了生长快、抗逆强的杂交条纹鲈；徐庆登等[2]通过鲫（Carassiusauratus auratus）（♀）和白鲫（Carassiusauratuscuvieri）（♂）的杂交得到生长速度比母本快1～2倍的高邮杂交鲫。目前，海水鱼类的杂交研究主要集中在鲷类和鲆鲽鱼类。研究表明，平鲷（Rhabdosargussarba）（♀）和真鲷（Pagrosomusmajor）（♂）杂交[3]，黑鲷（Sparusmacrocephlus）和灰鳍鲷（Sparusberda）杂交[4]，均能得到生长优势明显的 F1代。刘清华[5]通过对牙鲆（Paralichthysolivaceus）（♀）和夏鲆（Paralichthys dentatus）（♂）杂交，得到体重是牙鲆2倍的杂交鲆，并对其遗传力进行了估计；Wang等[6]用石鲽（Kareius bicoloratus）和牙鲆杂交，得到了生长优势和抗性明显的F1代。关于鲆类和鲽类的杂交，Wang等[6]研究了牙鲆与石鲽科间杂交后代的早期发育和生长情况，证明鲆鲽鱼类属间甚至科间可以进行杂交；李珺竹等[7]对牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交F1代的发育及遗传学进行了研究，证明牙鲆和圆斑星鲽杂交可以产生F1代。

随着生长过程中性腺的发育和成熟，鲆鲽鱼类腹部的隆起影响了其外观，从而降低了其商品价值[8]。更为重要的是，在性腺发育成熟的过程中会消耗掉大量的能量，延缓甚至阻碍了个体的生长。因此，研究鲆鲽鱼类的不育性对于提高其商品价值和养殖利益具有重要意义。鱼类的三倍体因其染色体组的不平衡性，通常无法产生正常的生殖细胞，因此具有不育性或低育性[9]。由于其生长快、易于饲养、且不会干扰鱼类资源等特点，三倍体鱼已成为国内外水产科学研究者的研究热点。将杂交和多倍体2种选育手段相结合，理论上不仅可以使杂交子代综合双亲的优良性状、增加变异性，获得杂交优势，还能得到多倍体的生长速度快和不育等特性，从而获得抗逆性高、生长速度快和不育的优良品种。早在1943年，Makino等[10]就开始了人工诱导鲤（Cyprinuscarpio）三倍体的研究，之后Swarup[11]成功诱导了三刺鱼（Gasterosteusaculeatus）的三倍体。自1980年代，三倍体诱导技术出现了长足进展。在海水鱼类方面，国内外已经先后在鲑鳟类[12]、鲆鲽类[13]、真鲷[14]、黑鲷[15]和大黄鱼（Pseudosciaena crocea）[16]等鱼类中成功诱导出三倍体，并对F1代胚胎发育过程、染色体核型鉴定等进行了初步研究。关于杂交三倍体的诱导研究，Purdom[17]诱导欧鲽（Pleuronectesplatessa）（♀）和川鲽（Platichthysflesus）（♂）的杂交三倍体获得成功，并养成成鱼；三倍体湘云鲫除不育的特点外，还具有生长快（比普通鲫鱼生长速度快2～3倍）、抗逆性强、肉质优、易捕捞、易垂钓等优点[18]。在海水鱼类方面，蔡明夷等[19]通过冷休克法诱导出大黄鱼和黄姑鱼（Nibeaalbiflora）的杂交三倍体，但尚没有大量培育异源三倍体养殖群体的报道。

本研究通过静水压法诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体，筛选最佳的诱导条件，旨在为鲆鲽类异源多倍体的培育和生产应用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的雌性牙鲆和雄性圆斑星鲽亲鱼来自山东省烟台市黄海水产有限公司，亲鱼产卵前2个月进行控温控光，牙鲆和圆斑星鲽亲鱼分开养殖，养殖温度为14～16℃，遮光率为70%～90%，并用优质饵料喂养。挑选体色和形态正常、体格健壮、性腺发育良好的亲鱼，人工挤压亲鱼腹部，收集成熟的牙鲆卵和圆斑星鲽精子，用干法受精得到受精卵，受精卵培育在（15.0±0.2）℃盐度30的海水中。

1.2 静水压诱导

为获得最佳的杂交三倍体的静水压诱导条件，参考林琪[16]、许建和[20]和戈文龙[21]等人的研究数据，用水压机（Biopress YB－5610，日本）对受精率进行处理，对受精后的处理起始时刻（Timing after fertilization，TA）、加压时间（Duration，D）和压强强度（Pressure，P）进行筛选。

对杂交三倍体诱导处理起始时刻（TA）的筛选，参考戈文龙[21]牙鲆减数分裂雌核发育技术，在温度为（15.0±0.2）℃条件下，受精后3min进行静水压处理为最佳处理时刻。

对压强强度（P）进行分析实验，设置压强为55、60、65、70、75、80和85MPa，共7个梯度处理受精卵。处理温度为（15.0±0.2）℃，处理时刻为受精后3min，根据预备实验，设定加压持续时间为6min，对照组取未经处理的同批次的受精卵，实验重复3次。

加压持续时间（D）的筛选设置2、4、6、8和10min，共5个处理梯度，处理压强为70MPa，在筛选出的适宜压强条件下处理受精卵，处理温度为（15.0±0.2）℃，处理时刻为受精后3min。对照组取同批次的受精卵，实验重复3次。

1.3 相对孵化率的计算

各实验组和对照组在加压处理2h后，取上浮的受精卵1 000粒在（15.0±0.2）℃盐度30的海水中孵化，及时去除下沉的受精卵，观察各发育时期并记录存活胚胎的数目。胚胎孵化完成后，计算孵化率，将各实验组的孵化率除以对照组的孵化率，得出各实验组的相对孵化率。

1.4 三倍体率的计算

每个实验组随机选取50尾孵化7d后的仔鱼，利用Ploidy Analyser PA－Ⅰ（Partec，德国）倍性分析仪检测DNA的相对含量，计算出每组的三倍体率。将每仔鱼苗放入1个1.5mL的离心管中，用蒸馏水洗涤，随后向离心管中加入0.2mL的PBS，将鱼苗研磨成单个细胞，制成单细胞悬浊液，研磨完毕后，向每个离心管中加入2mL PARTEC染色剂，充分染色后，通过滤膜过滤，滤液装入倍性分析仪配套的5mL试管中，将单细胞悬浊液混合均匀，将试管置于倍性分析仪中检测样品的DNA相对含量[22]。用正常杂交未处理的胚胎作为对照组。

1.5 染色体制备

随机选取在最佳诱导条件下处理的脱膜孵化期胚胎100枚，对胚胎进行秋水仙素处理，0.075mol/L的KCl进行低渗处理，用卡诺试剂（乙醇与冰醋酸体积比3∶1）固定，用50%醋酸作为解离液将材料研磨成单细胞后滴片，滴片后在55℃下干燥，干燥后用Giemsa染色，在显微镜下观察染色体和计数[23]。

1.6 数据分析

运用SPSS 17.0统计各组诱导鱼苗的相对孵化率和三倍体率的平均值和标准差，并进行单因素方差分析（One－Way ANOVA），用Games－Howell对各诱导组间的数据进行多种比较。

2 结果

2.1 静水压压强的确定

静水压法人工诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体不同压强处理的结果见表1。从表中可以看出，在海水温度为（15.0±0.2）℃，处理起始时刻为受精后3min，处理持续时间6～8min条件下，各实验组的相对孵化率随着压力强度的增加而下降，当压力达到85 MPa时，受精卵全部死亡；在实验压力强度范围内，三倍体的诱导率会随着压力强度的增加而升高。60MPa组和65MPa之间相对孵化率不存在显著差异（P＞0.05），但三倍体率之间存在显著差异（P＜0.05）；65 MPa组和70MPa组之间相对孵化率和三倍体率之间不存在显著差异（P＞0.05）；70MPa组和75MPa组之间相对孵化率存在显著差异（P＜0.05），但三倍体率之间不存在显著差异（P＞0.05）。综合以上分析，在静水压压力为65和70MPa时诱导效果最佳，这2个实验组之间没有显著差异；但70MPa三倍体率高于65 MPa组，因此，在实验条件下，为得到较高的三倍体率，应选择70MPa的压力最佳。

表1 不同压力强度下的相对孵化率和三倍体诱导率Table 1 Relative hatching rates and triploidy rates under different pressures

2.2 加压时间的确定

静水压法人工诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体不同加压时间的诱导结果见表2。从表中可以看出实验组的三倍体率在压力承受范围内与加压时间成正比，相对孵化率与加压时间成反比，在加压时间持续10min后，胚胎全部死亡。4min组和6min组相比，相对孵化率和三倍体率之间都存在显著差异（P＜0.05），6min组和8min组相比，8min组的相对孵化率显著低于6min组（P＜0.05），8min组三倍体率略高于6min组，但两者之间不存在显著差异（P＞0.05），综合三倍体率和相对孵化率2个因素，最佳加压时间为6min。

2.3 倍性鉴定

2.3.1 DNA的相对含量采用倍性分析仪检测对照组和实验组仔鱼的DNA相对含量，设置对照组DNA的相对含量为100（见图1a）。经检测，实验组中三倍体杂交种DNA的相对含量在150左右（见图1b），而未诱导成功的二倍体杂交种DNA的相对含量与对照组一致。

表2 不同加压时间的相对孵化率和三倍体诱导率Table 2 Relative hatching rates and triploidy rates in various experimental groups by different duration of pressure shock

图1 对照组二倍体（a）和实验组三倍体（b）相对DNA含量Fig.1 Relative DNA content of control group diploid（a）and experimental triploid（b）by ploidy analyzer

2.3.2 胚胎发育与染色体观察结果在海水温度为（15.0±0.2）℃时，采用优化的最佳诱导条件：受精后3min起，以70MPa压力处理6min，大部分胚胎在早期发育正常，24.06%的胚胎能够孵化出正常仔鱼（见图2）。受精后2h后，出现第一次卵裂进入二细胞期，2.5h后进入四细胞期，3h后进入八细胞期；受精后12h，胚盘突出卵黄，进入囊胚期；受精后16h后，胚盘下包，进入原肠早期，28h后进入原肠晚期，胚体开始形成；受精后36h，胚胎中部形成多个体节，并出现克氏泡，进入体节期；受精后72h，胚体破壳而出，发育成初孵仔鱼。

从该实验组随机选取的100枚胚胎经染色体处理和制片观察，有77枚胚胎可以看到染色体分裂相。其中染色体数目为47条的有49枚胚胎，占总数的63.63%（见图3a），已由的报道显示，牙鲆二倍体染色体为2n＝48，而圆斑星鲽二倍体染色体位2n＝46，其杂交后代的染色体数为2n＝47[10]，因此，这些胚胎应该是牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）的杂交二倍体；25枚胚胎的染色体数目为71条左右（见图3b），占总数的32.47%，即本实验所要诱导的杂交三倍体；此外，有3枚胚胎的染色体数目仅为24条（见图3c），可能是未能受精的牙鲆的单倍体，占总数的3.9%。

图2 牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交的胚胎发育Fig.2 Embryonic development of P.olivaceus×V.variegatus

图3 牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交后代的染色体中期分裂相Fig.3 Metaphase spread from offspring of P.olivaceus×V.variegatus

3 讨论

3.1 异源三倍体的诱导方法和诱导条件

目前用于人工诱导三倍体的主要方法有化学方法、生物学方法和物理方法等。化学方法是用化学药物处理受精卵，干扰细胞的分裂，主要用的化学试剂有聚乙二醇、细胞松弛素、6－二甲基氨基嘌呤等[24]。生物学方法主要有远缘杂交、细胞融合和核移植等。目前远缘杂交产生多倍体的具体机理还不清楚，细胞融合容易得到染色体数目并存的嵌合体鱼，而核移植技术还需要进一步的发展和完善。与上述2种方法相比，物理方法在诱导三倍体的研究中使用得更加普遍。静水压法是一种常用的物理方法，具有处理时间较短、诱导率较高、压力传导均匀、诱导过程中对受精卵的损伤较小等诸多优点，可以广泛应用于冷水性和暖水性鱼类的诱导。该方法的原理是通过高强度的压力使受精卵内原有的微管结构发生变化，破坏纺锤丝的形成，暂时阻断减数分裂的过程，抑制受精卵第二极体的排出，从而使染色体加倍。静水压诱导法已经在斑马鱼雌核发育[25]、水晶彩鲫（Carassiusauratustransparentcoloredvar.）三倍体和四倍体[26]、虹鳟（Sahnomykiss）四倍体[27]、大黄鱼三倍体[16]、黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）多倍体[28]和牙鲆雌核发育[21]等的诱导中，被证实要优于热休克法和冷休克法等物理方法。本研究诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体的成功，也再次证明静水压法是一种非常方便实用的多倍体诱导方法。

使用静水压法人工诱导鱼类三倍体，其诱导效果主要受处理时刻、处理压强和压力持续时间3个因素的影响。由于处理的研究对象相同，都是抑制牙鲆卵的第二极体释放，且处理温度一致，因此本研究的受精后处理时刻（TA）直接采用了牙鲆三倍体的最佳诱导条件（TA：3min，P：60～70MPa，D：6min）[14]。而处理压强稍有不同，则可能是由于异源精子诱导或是不同群体的鱼卵之间存在一定的差异造成的。但是，与其它海水鱼三倍体诱导的最佳条件相比，这一压力强度和处理时间明显高于或长于许多海水鱼三倍体诱导的压力强度和处理时间（大黄鱼P：45MPa，D：3min，TA：3min；舌鳎 P：36MPa，D：4min，TA：5 min）[16，29]，这可能是由于不同鱼类的受精卵对压力刺激的敏感性不一样，从而造成了耐受压力的不同。

3.2 三倍体的诱导效果

不同鱼类杂交三倍体的诱导率之间差异较大。余波[30]对虹鳟（Oncorhynchusmykiss）和美洲红点鲑（Salvelinusfontinalis）杂交三倍体的诱导率为93.3%，蔡明夷等[19]对大黄鱼和黄姑鱼杂交三倍体的诱导率达到100%，而本次实验最佳条件的诱导率为（26.67±6.67）%。不同的诱导效果可能与不同的诱导方法、物种之间的敏感程度或倍性的检测方法有关，也可能受种群地理分布的影响。本次研究在最佳诱导条件下的诱导率相对较低，可能与卵子的质量也有较大关系。由于实验所用卵子是通过人工挤卵获得，鱼卵的成熟程度和成熟的均一性可能难以保证，在受精后极体的排出时间会存在差异，导致诱导效果不同。

本研究在实验组的染色体制片观察时发现了3枚单倍体胚胎，但在DNA含量分析以及对照组中却没有发现单倍体。究其原因可能是因为在DNA含量分析时用的是初孵仔鱼，染色体制片时用的是胚胎，在发育过程中单倍体胚胎会因为“单倍体综合征”死亡。远缘杂交产生单倍体的原因，一方面可能是异源精子在受精过程中，种间生殖细胞会产生不亲和现象，导致牙鲆卵未受精，发生雌核发育。远缘杂交过程中诱导产生雌核发育或雄核发育的现象时有发生，Stanley[31]在以色列镜鲤（C.carpio）（♀）和草鱼（Ctenopharyngodon idella）（♂）的杂交后代中发现少数雄核发育个体；桂建芳等[32]在鲤（C.carpio）（♀）和鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）（♂）的杂交组合中，发现既有雌核发育的单倍体也有雄核发育的单倍体；刘颖[33]通过对大黄鱼和黄姑鱼的正反交实验，对存活的17尾幼鱼进行AFLP分析，也发现其中1尾幼鱼是由大黄鱼雌核发育的单倍体。

比例较高的单倍体胚胎存在，说明牙鲆卵子和圆斑星鲽精子之间受精还存在一定障碍，牙鲆与石鲽间[6]、牙鲆与圆斑星鲽间[7]间杂交虽然具有较高的受精率和孵化率，但毕竟这些种属于不同的科，鱼类不同科间的远缘杂交虽有一些报道，如奥利亚罗非鱼（Oreochromisaurea）（♀）×鳜（Sinipercachuatsi）（♂）[34]，但成功者较少，杂交不亲和现象表现突出。这种亲缘关系较远的物种之间的受精困难，可能表现在在精子识别、精子进入、原核形成以及原核融合等多个环节与亲本各自种内受精有所区别，继而造成受精卵减数分裂和早期发育速度等发生变化，这也可能是造成本次诱导成功率较低的原因。因此，要想获得牙鲆×圆斑星鲽异源三倍体更高的诱导效果，诱导条件可能尚需进一步优化。

4 结语

本研究通过静水压法筛选出诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体的最佳条件，在温度为（15.0±0.2）℃下，TA：3min，P：70MPa，D：6min。在最佳条件下的诱导率为（26.67±6.67）%。

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