不同蛋白水平饲料对刺参生长和消化酶活性的影响＊

冯 丹，高勤峰，董双林

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛266003）

刺参饲料的研究近年来不断开展，生产上大多采用天然藻粉，如马尾藻粉、海带粉、石莼等，并添加一定比例的动物蛋白，以适应刺参对蛋白的需求。鱼粉是以一种或多种鱼类为原料，经去油、脱水、粉碎后加工而成的蛋白饲料，其易消化、适口好的特点，使它成为配制水产生物饲料的优质蛋白源[1]。

稳定性同位素作为一种天然示踪剂，应用广泛。它之所以可以作为理想的生物标记物追踪消费者体内同位素的变化，是因为消费者体内同位素组成和食物来源一致[2]，并随食物同位素的改变而改变。因此，通过追踪消费者组织稳定性同位素的变化，可以了解消费者生命活动的变化，如食性转变、代谢情况等。近几十年来，稳定性同位素技术广泛应用于消费者食性分析的研究中，可利用消费者稳定同位素比值与其食物相应的同位素值的相近关系来判定消费者的食物来源，并确定食物中各成分的贡献比例。

刺参体内存在多种消化酶，其活性直接影响刺参对营养成分的吸收，进而影响刺参生长。消化酶活性的变化可直接反映刺参的生理变化及对食物环境的适应性，对消化酶的研究有助于掌握水产动物生长过程中的营养需求，从而为养殖过程提供一定依据。近年来，对刺参消化酶的研究屡见报道。刺参体内有十余种消化酶，其中研究较多的有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶[3－4]。消化酶活性受多种因素影响，如温度、pH 等[5]。孙双双等[6]通过实验证明刺参消化酶受盐度影响，其中淀粉酶和蛋白酶在盐度为30时活力最大。不同生长阶段刺参消化酶活性也是不同的[7]。

本实验通过添加不同含量的鱼粉，调节饲料中的蛋白水平，对刺参进行饲养实验，通过应用稳定性同位素技术和对消化酶的测定，探究饲料中蛋白含量对刺参生长和消化酶的影响，以得到最适合的鱼粉添加比例，为刺参配合饲料的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 饲料制作

以鱼粉、马尾藻和海泥为主要原料，分别将鱼粉按照0、2%、5%、10%、15%和20%的比例添加，并添加20%海泥，所有原料经粉碎后过200目筛粉碎后混合并制粒，分别标号为 A、B、C、D、E、F，装袋备用。各饲料组成及营养成分如表1所示。

1.2 养殖实验

实验所需刺参购于山东青岛田横某养殖场，选取健康无病，大小一致（（19.28±0.11）g）的刺参作为实验材料。将刺参放入玻璃缸中暂养10d以适应实验室条件，暂养期间投喂饵料为含20%海泥的海带粉。

将预处理后的刺参随机分配至36个玻璃缸（50 cm×30cm×40cm），每缸4头，本实验共设6个饲料处理，每个处理设置6个玻璃缸作为6个平行。实验过程中，按照每缸刺参体重的3%～5%投喂上6种饲料，实验时间为12周，每日16∶00左右投饵一次；控制水温在15℃左右，盐度31～32，pH＝7.8～8.2；每日换水量为1/3，连续充气，及时清除残饵和粪便保证良好的养殖环境，观察刺参的摄食情况，遮光条件饲养[8]。

表1 饲料组成及营养成分（平均值±标准差）Table 1Ingredients，nutrient content of the diets（mean±SD）

实验过程中，分别于初始时间、第一周、第二周、第四周、第八周和第十二周进行取样，每次取样时对应于每个饲料处理组选取3个平行玻璃缸，从每个玻璃缸中取一只刺参，即每个饲料处理采样3只刺参，称取湿重，取肠道样，冷冻保存，并烘干体壁样保存，待测定。

1.3 实验数据测定

1.3.1 特定生长率测定 实验开始时测定经饥饿排空的刺参的初始体重，实验过程中进行日常饲养管理，实验结束后测定饥饿一天的刺参体重。

刺参的特定生长率（Specific growth rate，SGR）公式：

SGR（%·d－1）＝100（lnWW2－lnWW1）·T－1，WW1和WW2分别为每一玻璃缸中刺参的初始和终末体重；T为实验时间（84d）。

1.3.2 同位素数值及饲料食物贡献率测定 将每次取样烘干后的刺参体壁以及饲料和原料样品经研磨并过200目筛后干燥保存。

所得样品的的稳定同位素值在中国林业大学环科院同位素分析实验室进行分析，用德国Finigan公司生产的Flash EA1112HT元素分析仪分析，质谱DELTA V通过检测测得比率[8]。计算公式如下：

δX＝[（Rsample/Rstandard）－1]×1 000‰，式中，X是13C或15N；Rsample代表所测得的同位素比值，碳同位素是13C/12C，氮同位素是15N/14N，R 是国际通用标准物的重轻同位素丰度之比。碳稳定同位素标准采用PDB[9]，氮稳定同位素标准采用大气氮[10]。

1.3.3 消化酶活力测定 分别于第一周、第二周、第四周、第八周和第十二周取样。实验前饥饿24h使其胃排空，将预处理后的刺参放在冰盘中取其肠道，清除粪便，将肠道样品迅速放入液氮中冷冻，之后放入－80℃冰箱保存。测定时，将每个肠道样品按照1∶4加入预冷的生理盐水，在冰浴条件下匀浆，制成20%的匀浆液，然后将匀浆液置于高速冷冻离心机中，4℃，2 500r·min－1，离心10min，所得上清液即为酶液。

蛋白酶及淀粉酶活性均采用南京建成生物工程研究所生产的酶测定试剂盒进行测定。蛋白酶活性定义为在一定的pH和温度下，每分钟水解酪蛋白产生1μmol酪氨酸为1个酶活力单位（U）。淀粉酶活性单位（U）定义为一个淀粉酶单位在25℃和pH＝6.9条件下，从可溶性淀粉中释放出1μmol还原物质（以麦芽糖计算）所需的酶量[8，11]。

1.3.4 实验统计分析 数据以平均值±标准差（mean±SD）表示，利用SPSS16.0等软件对实验数据采用单因子方差（ANOVA）和Duncan多重比较进行分析处理，以P≤0.05为差异显著[8，11]。

2 结果

2.1 特定生长率

各组存活率、初始与终末体重及特定生长率见表2。F组刺参存活率最低，可能是由于初始阶段对高脂肪饲料不适应，导致有些刺参出现化皮、吐肠的情况，使得这组刺参成活率最低。实验开始时，各处理组湿重无显著差异（P＞0.05）。经过十二周饲养，不同处理组刺参湿重发生明显变化。从特定生长率看，投喂饲料C和D的刺参组特定生长率最高，且二者无显著差异（P＞0.05），投喂饲料F的刺参组特定生长率最低，显著低于其他组刺参（P＜0.05）。对照组即A组，低于除F组之外的其他组，但与B、E组无显著差异（P＞0.05）。

表2 不同处理组刺参存活率及初始、末体重（平均值±标准差）Table 2 Survival rate、initial and final wet weight of A.japonicus for six diet treatments（mean±SD）

2.2 同位素数据及饲料食物贡献率

实验过程中每次取样所得的体壁碳同位素数据如图1所示。由图中可以看出，投喂同位素碳值分别为－15.64±0.23、－16.25±0.12、－16.62±0.18、－16.79±0.25、－16.98±0.21、－17.03±0.12的新食物后，各组碳同位素值均随饲养时间的增加呈递增的趋势，逐渐向新食物稳定性同位素碳值迁移。实验开始一周后，A组和D组与其他组之间差异显著（P＜0.05），其他各组变化不大，无显著差异（P＞0.05）；从第二周开始各组均出现显著差异（P＞0.05）。从整体看，E、F组变化趋势较平缓，F组最平缓。其他各组则呈现显著的变化趋势，且均表现为从初始到第四周增长迅速，第四周至实验结束增长缓慢。

图1 蛋白含量对刺参稳定性同位素碳值的影响Fig.1 Effect of protein contents onδ13C values of sea cucumbers

实验结束后各成分食物贡献率如表3所示。由表中可以看出，由于海泥的贡献率极低，因此食物贡献率变化主要体现在马尾藻和鱼粉上。对照组即A组，饲料中只有马尾藻和海泥，因此马尾藻的食物贡献率是所有组中最高的；在鱼粉添加量为0%～10%内，随着鱼粉添加量的增加，马尾藻的食物贡献率逐渐降低，之后没有明显的变化趋势。鱼粉的食物贡献率则呈现与马尾藻相反的趋势，即在添加量为0%～10%范围内，随鱼粉添加量的增加而升高，添加10%鱼粉组（D组）最高，之后降低。

表3 不同处理组的刺参食物贡献率Table 3 The food contributions of the feed constituents to the food of sea cucumbers in the 6diet groups

2.3 消化酶活性

分别于饲养一周、二周、四周、八周和十二周取样测得的蛋白酶活力见图2。由图可以看出，第一周时各组蛋白酶活力无显著差异（P＞0.05），经过一段时间饲养，蛋白酶活力开始出现差异，且趋势基本一致，即在蛋白含量为12%～18%，蛋白酶活力随蛋白含量的增加而增加，之后下降，且蛋白含量为18%和23%组无显著差异（P＞0.05），这2组蛋白酶活力与其他组差异显著（P＜0.05），蛋白含量最高组蛋白酶活力最低。且对于每组而言，分别于不同时间取样，即随着刺参的生长，其蛋白酶活力总体是上升的趋势。

分别于饲养一周、二周、四周、八周和十二周取样测得的淀粉酶活力见图3。由图可以看出，淀粉酶的活力变化从第四周开始与蛋白酶活力变化规律基本相同，均随着蛋白含量的增加而增加，至蛋白含量为18%时最大，之后降低。前两周则是蛋白含量为23%组最高。就每组而言，随着刺参生长，淀粉酶活力在饲养一周至二周内降低，之后升高，第四周至第八周期间变化幅度较大。

图2 蛋白含量对刺参蛋白酶活力的影响Fig.2 Effect of protein contents on protease activity in sea cucumbers

图3 蛋白含量对刺参淀粉酶活力的影响Fig.3 Effect of protein contents on Amylase activity in sea cucumbers

3 讨论

由特定生长率结果可以看出，刺参在投喂蛋白含量为23%的饲料表现出最大特定生长率，且与投喂蛋白含量为18%的饲料组无显著差异。单就特定生长率看，投喂5%～10%的鱼粉，即蛋白含量在18%～23%都是合适的。超过23%后，特定生长率随蛋白含量的增大呈减小的趋势，且蛋白含量最高组刺参基本表现为不生长，可能与饲料本身脂肪含量过高有关，过高的脂肪含量对刺参的摄食有抑制作用。朱伟等[12]研究认为，刺参饲料的粗蛋白适宜含量为18.21%～24.18%，与本实验结果基本一致。超过24%，刺参特定生长率随蛋白含量的上升而下降，在其他动物如罗非鱼[13]和凡纳滨对虾[14]中也有相同现象。

研究表明，生物体在代谢过程中倾向于将质量较轻的12C同位素排出体外，从而导致质量较重的13C在其体内慢慢积累，最终使生物体和其食物碳稳定同位素值间存在差异[9，15]。当生物体更换食物时，其组织碳稳定同位素值也将向新食物的碳稳定同位素值迁移。本实验中，投喂添加6种不同含量鱼粉的饵料，结果与之前研究相似，即刺参同位素向6种不同新饵料同位素值迁移。其中E、F组刺参同位素碳值变化不大，这从其特定生长率也可以看出，尤其F组刺参基本表现为不生长，可能是因为饵料脂肪含量过高，抑制刺参的摄食和消化，从而使得同位素碳值变化不大；而添加了蛋白的其他组则表现出比较明显的变化趋势。由于刺参代谢较慢，碳同位素周转周期较长。研究表明，消费者稳定同位素周转速度，取决于消费者的生长速率和新陈代谢速率2个因素[16－19]。孙 侦龙[20]指出，在 刺参肠道和体壁中，新陈代谢对碳稳定同位素周转的贡献比例分别高达80%～90%和60%～75%，即新陈代谢速度影响碳同位素在刺参体内的周转，添加适当蛋白可提高刺参的新陈代谢功能，如提高某些消化酶的活力等，从而提高碳同位素的周转速率。且随着饲养时间的增加，刺参体重发生变化，相应的也会影响刺参稳定同位素的周转速率，Tieszen[21]等的研究表明，体重越大的动物其碳稳定同位素周转速率越慢，因此实验后期碳同位素值增长幅度降低。

从表3中可以明显的看出饲料各成分的食物贡献率，其中马尾藻的食物贡献率与鱼粉的食物贡献率基本呈现负相关。从生长和消化酶活力来看，添加一定量鱼粉蛋白有利于刺参生长，鱼粉的食物贡献率也与鱼粉添加量有一定相关性，当鱼粉添加比例在10%时，鱼粉的食物贡献率最高，此时马尾藻的食物贡献率最低。继续添加，鱼粉的食物贡献率下降，过高的鱼粉既造成鱼粉的浪费又阻碍刺参对其他成分的吸收，造成特定生长率下降。

由图2和3可以看出刺参消化酶，主要是蛋白酶和淀粉酶活力随饲料鱼粉蛋白含量的变化趋势。当刺参摄食不同蛋白含量的饲料后，会通过体内消化酶的调节来适应饲料的变化，因此对饲料有适应性变化。对于蛋白酶来说，总体趋势是蛋白酶活力随蛋白含量的增加先升高后降低，在鱼粉添加量为5%～10%，即饲料中蛋白含量为18%～23%时最高。饲料中添加蛋白，刺参要通过调节蛋白酶活力使之能消化相应的蛋白，但这个适应性调节需要一定的时间，因此在实验初期，蛋白酶活力并没有比较明显的变化，经过一段时间的饲养，蛋白酶活力呈现出如图所示的趋势，当添加鱼粉比例超过10%时，蛋白酶活力开始降低，这可能与消化道内蛋白酶活力性的产物抑制作用有关，还有待进一步研究。由于刺参体内消化酶活力较低，过多的蛋白会加重机体负担[22]，反而不利于刺参对蛋白的吸收。且就总体而言，蛋白酶活力始终随着养殖时间的增加而升高。这可能与发育期和规格有关，唐黎等[7]研究表明，刺参体内消化酶，尤其是蛋白酶与淀粉酶活力随个体发育而逐渐上升，周玮等[23]研究也表明，刺参不同生长阶段，消化酶活力变化显著。因此，从总体看来，随着饲养时间的增加，酶活力逐渐升高。可据此在刺参处于高速生长期时，调整饲料组成，使其符合刺参生长需求。初始淀粉酶的活力与蛋白酶活力相反，初始2周内淀粉酶活力随养殖时间的增加而降低，这可能是由于淀粉酶对蛋白的适应性不如蛋白酶适应性好，需要较长时间适应蛋白的变化，适应之后则表现出与蛋白酶变化相同的趋势，也说明刺参消化酶之间是相互影响的，即一种酶活力的变化会影响另一种酶的活力，当一种酶的活力提高时，会带动其他酶活力的提高，反之亦然，这与之前对消化酶的研究也是相符合的[24]。

综上所述，由刺参的生长、食物贡献率和消化酶活力综合来看，鱼粉添加量在5%～10%时，最利于刺参生长。

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