RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型的建立

于庆功++++++谷伟++++++王苏雅++++++张欣欣++++++杨子荣++++++李文哲

[摘要] 目的 利用shRNA表达载体建立FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型。方法 将化学方法合成的特异性FRAT1基因siRNA，以人类结肠癌HT29细胞为实验对象，采用Lipofectamine将FRAT1基因的shRNA表达载体导入细胞后，用RT-PCR和Western blot检测目标基因FRAT1的表达水平。结果 稳定转染FRAT1 shRNA表达载体（pSINsi-FRAT1）后，FRAT1基因在mRNA和蛋白质表达水平分别下降92.63%、55.72%（P<0.05）。结论 成功地建立了FRAT1基因沉默HT29细胞模型，为研究FRAT1生物学功能打下坚实的实验基础。

[关键词] FRAT1；结肠癌；转染；RNA干扰

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）03（b）-0012-05

人FRAT1（frequently rearranged in advanced T cell lymphomas-1）基因最初被认为是T细胞淋巴瘤的原癌基因，是FRAT（frequetly rearranged in advanced T cell lymphomas）家族中的一员[1-2]，研究表明FRAT1基因过表达在肿瘤发生中起关键作用，并已证实人结肠癌细胞存在FRAT1基因的高表达[3]。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是目前应用在逆向遗传学（reverse genetics）研究中高效的基因沉默技术，在功能基因组学和基因治疗的研究中得到广泛应用。RNAi技术可以关闭变异基因的表达，尤其是shRNA的应用，可对基因表达产生稳定强大的干扰效应，为肿瘤治疗提供了良好前景[4-5]。已有研究证明，利用RNAi技术特异性下调肿瘤细胞内高表达的癌基因或者抗凋亡基因，可使癌细胞对化疗和放疗的敏感性增加，抑制癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡，从而提高抗肿瘤效应[6-7]。本实验选择结肠癌HT29细胞株作为实验对象，通过转染化学合成的FRAT1 shRNA表达载体，建立长期稳定表达FRAT1shRNA的实验细胞模型，以期为研究FRAT1基因在结肠癌发病过程中的作用机制及基因治疗打下坚实的实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞培养

1.1.1 实验试剂 载体pSINsi-hu6购于大连宝生物公司，转染试剂Lipofectamamine（11668-脂质体2000）购于Invitrogen公司；筛选试剂G418（11811-023）购于美国Gibco公司；cDNA合成试剂盒，PCR试剂盒（上海生物工程公司）；引物（ULTRA PAGE）由上海生工生物工程股份有限公司合成；人结肠癌细胞株HT29（KG015）于南京凯基生物购买；DMEM培养基干粉（12100046-DMEM高糖-Y）为Gibco产品；胎牛血清（TBD21HB）购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；FRAT1兔抗人多克隆抗体（sc-130756）购自Santa cruz 生物公司；HRP标记山羊抗兔二抗（AB10058-Peroxidase-conjugated AffiniPure）购自碧云天生物技术研究所；ECL试剂盒从GE 医疗集团购买。

1.1.2 细胞培养 HT29细胞株（购自南京凯基细胞库）为本实验室保存，细胞复苏后用不含抗生素的培养基（DMEM+10%FBS）培养。

1.2 方法

1.2.1 设计和合成siRNA及表达shRNA的DNA模板链 FRAT1基因siRNA序列 CTF182-1-1（序列GCAGTTACGTGCAAAGCTT）；其阴性对照序列为CTF182-N-1（序列TCTTAATCGCGTATAAGGC）。序列GCAGTTACGTGCAAAGCTT用于设计和合成针对FRAT1基因的shRNA。表达FRAT1 shRNA的DNA模板包括两条链siRNA-sense：5′-GATCCAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCTGTGAAGCCACAGATGGGAAG CTTTGCACGTAACTGCTTTTTTTAT-3′；siRNA-antisense：5′-CGATAAAAAAAGCAGTTACGTGCAAAGCTT CCCATCTGTGGCTTCACAGAAGCTTTGCACGTAACT GCTG-3′，其中Sense中的斜体部分为BamH Ⅰ酶切位点，Antisense中斜体部分为Cla Ⅰ酶切位点。下划线部分为干扰序列及其配对序列，曲线部分为loop环形成序列。双链FRAT1siRNA和无功能siRNA均由大连宝生物公司合成。

1.2.2 构建重组FRAT1基因shRNA表达载体 提取pSINsi-hu6载体DNA，用BamH Ⅰ和Cla Ⅰ作双酶切，产物经琼脂糖电泳后回收备用。使用TE将两条DNA模板链溶解混匀后，根据以下条件退火形成双链：94℃ 5 min，缓慢降到30℃ 90 min，4℃保存。然后经T4 DNA ligase作用连入载体相应的克隆位点，连接载体pSINsi-hu6-FRAT1转化大肠埃希菌DH5，在琼脂平板挑取菌落进行增菌培养，取1 μl菌液作PCR，阳性者作DNA测序确定连接是否正确。

1.2.3 稳定转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体 转染前一天细胞更换新鲜培养基，次日在6孔板上按每孔500 μl（含细胞5×105个）接种细胞3孔，其中第1孔为未转染对照孔，第2孔为转染无功能siRNA对照孔，第3孔为转染pSINsi-hu6载体对照孔，第4孔为转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体。每孔细胞转染所需双链shRNA和Lipofectamine 2000分别是1 μl，0.8 μg。按Lipofectamine 2000使用说明进行细胞转染。转染24 h后每孔细胞分成3孔，分别加入G418（600 μg/ml）；以后每3天更换培养基和G418。等未转染对照孔细胞都被杀死后，终止G418筛选，用含10%FBS培养基培养具有G418抗性细胞，增殖到一定数量后，将其转到培养瓶中培养，定期用G418清除遗失抗性的细胞。另外同时筛选转染表达无功能shRNA质粒和转染pSINsi-hu6载体的HT29细胞作为阴性对照。

1.2.4 HT29细胞总RNA 抽提及RT-PCR 总RNA抽提按Trizol产品说明书进行。操作步骤如下：用PBS清洗两遍收集的细胞，RNA Trizol裂解，氯仿抽提，异丙醇、75%乙醇沉淀、洗涤后，溶解于DEPC水中，测定RNA浓度。利用提取的RNA进行RT-PCR，获得cDNA。RT-PCR按宝生物工程公司的试剂盒说明操作。RT条件为：42℃ 90 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.2.5 PCR 取cDNA作为模板扩增FRAT1和GAPDH，其中扩增FRAT1特异性引物为：sense primer：5′-GCCCTGTCTAAAGTGTATTTTCAG-3′，antisense primer：5′-CTCTGCAGTCCTACTCAAGCG-3′。扩增片段长325 bp。扩增GAPDH作为内参对照，引物序列分别是sense primer：5′-TCACCATCTTCCA GGAGCGAG-3′，antisense primer：5′-TGCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′。扩增产物长615 bp。PCR条件为：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 25 s，72℃ 7 min，4℃ 5 min，30个循环。相关产物在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。

1.2.6 转染细胞总蛋白的提取及Western blot鉴定 收集细胞后用预冷PBS清洗两遍，加入含PMSF的裂解液（1 ml含1 μl PMSF）200 μl，于冰上裂15 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清。蛋白浓度用BCA法测定，取上清12 μl，与3 μl 5×loading buffer混匀，100℃煮沸5 min，所得样品经SDS-PAGE电泳120 V 25 mA 150 min分离后，冰上电转至PVDF膜50 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，按顺序加入兔抗人FRAT1基因抗体（4℃过夜，次日TBS-T Buffer洗6次，5 min/次），H暗室曝光，显影，定影。底片在UVP凝胶成像系统下成像、保存。

1.3 数据分析

将PCR及蛋白印迹操作最后得到的胶片进行拍照扫描，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro Analyzer）进行分析。分别计算FRAT1各条带与内参GAPDH条带的相对光密度比值。重复3次实验。HT29细胞中FRAT1基因的含量设为1，转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞FRAT1基因下降率求3次平均值，得出FRAT基因表达的下降率。选用统计软件SPSS 13.0，采用两组独立样本的t检验分别分析3组转染组细胞中蛋白和mRNA的光密度与内参GAPDH光密度比值与空白对照组蛋白和mRNA与内参光密度比值，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 重组shRNA表达载体的鉴定

提取重组shRNA表达载体DNA进行测序鉴定，结果表明表达shRNA的DNA模板链已成功插入载体的正确位置（委托大连宝生物进行测序）。针对FRAT1基因的重组shRNA载体命名为pSINsi-hu6-FRAT1，而无功能shRNA载体命名为pSINsi-hu6-control（图1）。

图1 重组质粒电泳

A.CTF182-1-1；B.CTF182-N-1；C.CTF182pSINsi-hu6

2.2 阳性克隆的筛选

利用Lipofectamine 2000转染载体24 h后，对未转染对照孔，转染无功能shRNA对照孔，转染空质粒pSINsi-hu6对照孔及转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体孔进行G418筛选。经G418（600 μg/ml）筛选培养，第2天细胞开始死亡，到了第5天未转染对照孔细胞全部死亡。HT29细胞转染无功能shRNA、转染pSINsi-hu6载体及转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞10～14 d后，出现G418抗性克隆，然后降低G418浓度（300 μg/ml）继续培养2个月，细胞保持稳定增殖直至出现明显克隆形成。挑取单克隆从96孔-24孔-6孔-克氏瓶扩大培养。转染pSINsi-hu6-FRAT1筛选过程（图2）。实验结果证实成功筛选出携带重组FRAT1shRNA表达载体的HT29细胞系。

图2 pSINsi-hu6-FRAT1细胞的筛选（×100）

A.筛选第1天；B.筛选第5天；C.筛选第14天；D.筛选后的单克隆

2.3 FRAT1基因沉默效果

为了检测FRAT1基因沉默效果，先从未转染细胞、转染无功能siRNA的细胞、转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞及转染pSINsi-hu6载体的细胞进行RNA提取，并进行质量鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果显示，RNA没有被降解（图3）。利用提取的细胞总RNA，进行RT获得cDNA，再以FRAT1 特异性引物PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，发现扩增出大小约325 bp的目的基因片段（图4）。与转染pSINsi-hu6-control的细胞相比，转染pSINsi-hu6-FRAT1的HT29细胞FRAT1的表达明显下降，证明FRAT1 shRNA成功转染至HT29细胞中，且有良好的基因沉默效果，在FRAT1 mRNA水平与未转染细胞组相比，下降了92.63%（P<0.05），而转染无功能siRNA的细胞及转染pSINsi-hu6载体的细胞组与未转染细胞组相比mRNA水平没明显变化（P值分别为0.1172、0.1064）。

图3 FRAT1RNA在四组细胞中的提取

A.normal colon cell；B.CTF182-1-1；C.CTF182-N-1；D.CTF182pSINsi-hu6

图4 FRAT1mRNA在四组细胞中的表达

A.normal colon cell；B.CTF182-1-1；C.CTF182-N-1；D.CTF182pSINsi-hu6

为了进一步检测FRAT1基因沉默效果，从未转染细胞、转染无功能siRNA的细胞、转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞及转染pSINsi-hu6载体的细胞中提取细胞裂解液。蛋白定量后，进行Western blot检测，结果显示，与未转染细胞组相比，转染pSINsi-hu6-FRAT1表达载体的细胞的FRAT1 蛋白表达量下降了55.72%（P<0.05），转染无功能siRNA的细胞及转染pSINsi-hu6载体的细胞组与未转染细胞组相比，FRAT1蛋白含量没明显变化（P值分别为0.4340、0.1824）（图5）。

图5 FRAT1蛋白在四组细胞中的表达

A.normal colon cell；B.CTF182-1-1；C.CTF182-N-1；D.CTF182pSINsi-hu6

3 讨论

结肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，发病率成逐年增高趋势，且病死率位居恶性肿瘤的第二位，进展后的结肠癌预后差是病死率高的主要原因[8]。当前，结肠癌治愈的主要手段是以手术为主的治疗方法。然而，手术费用高且副作用大，其中局部复发和远处的肝转移是手术失败的主要原因。因此，预防局部复发和肝转移的早期诊断及时治疗，对高危人群的筛选和预测复发及转移，对提高患者的生活质量和生存率具有极其重要的意义。FRAT1是FRAT家族中的一员，FRAT1通过与蛋白质糖原合成酶激酶（GSK）3相结合，抑制GSK3对β-catenin的磷酸化，使胞质内游离的β-catenin 水平升高，β-catenin继而进入胞核，激活c-myc，cyclinD1等一系列癌基因的表达，正向调节Wnt信号转导通路，引起细胞异常增殖，最终致使细胞发生癌变[9-10]。研究证实，FRAT1在食管癌、卵巢癌、星形细胞瘤、脑胶质瘤、非小细胞肺癌、胃癌[11-16]中均有高表达，被认为是维持细胞恶性表型的关键因子。因此，FRAT1基因对结肠癌的基因治疗具有重要意义。

RNAi为目前最有效的基因沉默技术，RNAi是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因静默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）过程，为双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术[17]。RNAi能简便、快捷和特异性地下调靶基因，用于基因功能的研究。相对于传统的基敲除技术，RNAI技术具备投入少，周期短，操作简单等特点。本实验成功构建的FRAT1shRNA表达载体pSINsi-hu6在细胞内利用Ⅲ型RNA聚合酶（RNA polymerase Ⅲ），合成shRNA，exportin-5将其运输到胞质，由Dicer识别，胞质中裂解，产生siRNA，获得持续基因沉默效应。21个碱基序列的设计的合理性决定siRNA沉默效率，目前关键问题是如何设计针对目的基因的高效特异性siRNA。当今研究者们使用生物信息学、计算机辅助手段选择最佳siRNA[18-19]。实验中FRAT1基因在mRNA和蛋白质表达水平分别下降92.63%、55.72%（P<0.05），成功建立了FRAT1基因表达下调的实验细胞模型，可满足进一步研究FRAT1基因功能的要求。

综上所述，以pSINsi-hu6载体为介导，转染特异的FRAT1基因的siRNA，成功地构建了FRAT1基因表达下调的实验细胞模型，为FRAT1基因靶向治疗的可行性作了初步探索，为进一步诱导其对化疗药物的敏感性以及动物体内实验提供了理论及实验基础，为人结肠癌的生物治疗探索了一条新途径。

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（收稿日期：2014-01-09 本文编辑：郭静娟）

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（收稿日期：2014-01-09 本文编辑：郭静娟）