松材线虫内寄生菌Esteya vermicola研究进展

林 峰，叶兼菱，赵博光

（1.南京林业大学现代分析测试中心，江苏 南京 210037；2.江苏出入境检验检疫局，江苏 南京 210013；3.江苏南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037）

松材线虫内寄生菌Esteya vermicola研究进展

林 峰1，叶兼菱2，赵博光3*

（1.南京林业大学现代分析测试中心，江苏 南京 210037；2.江苏出入境检验检疫局，江苏 南京 210013；3.江苏南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037）

介绍了松材线虫内寄生菌（Esteya vermicola）的发现、鉴定、分类地位及主要形态特征，对其与松材线虫的相互作用进行了回顾，并对其在松萎蔫病生物防治中的运用前景简要进行了讨论。

松材线虫；Esteya vermicola；内寄生菌

松萎蔫病是主要由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）［1］一种松树毁灭性病害，该病已蔓延到中国、韩国、墨西哥、葡萄牙、西班牙、希腊、葡萄牙、尼日利亚等国家［2－4］。给全球的森林生态系统造成不可估量的损失［5－6］。由于对其致病机理尚未研究清楚，因此，目前虽有熏蒸、燃烧、砍伐病木，空中喷洒杀虫剂，和树干注射，生物防治等防治措施，但均未能真正拔除疫点或控制疫区。

真菌对线虫拮抗活性表现出一系列的特异性和作用方式，极具开发成为生物杀线虫剂的潜力［7］。研究表明，松材线虫的相关微生物，包括一些食线虫真菌，食料真菌或细菌等，均表现出引诱松材线虫的能力［8－10］。一些食线虫菌物的培养液和活菌丝对线虫均有吸引效果。其中，内寄生菌物表现出最强的吸引效果，其次是捕食线虫菌物和非食线虫菌物［11］。Esteya vermicola是从我国台湾在世界上首例报道的松材线虫的内寄生真菌［12］。它对松材线虫具有巨大的生物防治潜能［13］。该真菌与松材线虫的关系也作了一些研究［12－20］。Tzean等［15］将其作为一种潜在的防治线虫的生物防治剂在美国申请了专利。有关E．vermicola的生物学，生态学数据，对寄主感染的机制，以及潜在的作为生物杀线剂的相关内容尚待研究。

1 Esteya vermicola的生物学特性

Esteya vermicola为至今唯一被报道的可在松树寄主内建立种群的松材线虫内生真菌。属真菌界（Fungi）子囊菌门（Ascomycota）子囊菌纲（Ascomycetes）肉座菌目（Hypocreales）Ophiostomataceae科埃斯特氏属唯一的种［12］。

模式种：形态特征描述如下［21］：在PDA平板上菌落生长速度适中，灰色、灰绿色至暗绿色；背面灰色至暗绿色。菌丝分枝，分隔，无色、近无色至淡灰绿色，光滑、粗糙，直径2～4 μm。具2型分生孢子梗，产孢细胞和分生孢子。第1型分生孢子梗粗大菌丝状，单生，直立，基部阔安瓿形，分生孢子梗大小为：［（10）16～29（62）］μm×（3～4.4）μm，梗向顶端渐细，形成一个极细的瓶颈，瓶颈直径为1.5～1.9 μm，近无色至淡绿色，光滑、粗糙至十分粗糙。分生孢子单生，单细胞。不规则椭圆形，半月形，向内凹陷，末端稍尖，无色壁光滑，（8.2～11.1）μm×（3.5～3.7）μm，分生孢子内含类似内寄生孢子的结构，分生孢子具粘性。第2型分生孢子梗粗大菌丝状、单生或分枝，直立，柱状，分隔，无色、近无色至淡灰绿色，光滑、粗糙至十分粗糙，长（22.2）34.1～43 μm，基部宽3～4.4 μm，顶部直径1.5 μm。第2型分生孢子单生，单细胞，杆状、柱状，无色，光滑，［（3）4.4～7.4］μm×（1.5～1.9）μm，孢子无粘性，常在瓶颈顶端聚集，以第1型半月状粘性孢子寄生线虫。从线虫体内长出的主要是第1型的分生孢子梗和分生孢子。

迄今在全球范围内已报道的E．vermicola有3个菌株。ATCC 74485为模式种，从台湾被侵染的松材线虫虫体上首次分离得到［12］。它的主要特征是具2种不同类型的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子，第1型分生孢子半月形，第2型分生孢子为杆状。其中仅以第1型半月形粘性孢子侵染松材线虫。该真菌对松材线虫有非常高的侵染率。实验证明，几乎100%的供试松材线虫被该菌株的半月形孢子侵染，并在8～10 d内全部被杀死［12］。另1株菌株CBS 115803在捷克斯洛伐克发现［22］，说明该菌株作为松材线虫的天敌，可能广泛分布在全球范围内［13］。随后，2006年在韩国的1次食线虫菌物调查中分离得到1株菌株CNU 120806，被鉴定该菌的新菌株［16］。

Wang等［13］基于28S rRNA基因序列分析，发现CNU 120806与CBS 115803这2株菌株亲缘关系最近，有着100%的同源性。它们同属Esteya属，而E．vermicola是该属唯一的种。CNU 120806与另外2株已报道的菌株ATCC 74485和CBS 115803具有相似的形态学特征及侵染模式，但仍有一些区别。

此外，E．vermicola还有2株菌株，CBS156.82和CBS100821，由皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心（CBS）于1982和1998年分离得到，地点分别是在日本和意大利。在E．vermicola被命名和详细描述之前，这2株菌株一直被命名为其他名字，因此几乎不为人所知［17］。

2 E．vermicola的寄主和侵染线虫过程

E．vermicola的寄主主要是线虫。通过试验发现该菌株仅对地上部的植物寄生性线虫Aphelenchoides besseyi，Aphelenchoidessp.及Bursaphelenchus xylophilus有寄生作用［12－13，16，18，24］。Wang等［13］发现CNU 120806菌株对腐生线虫Panagrellus redivivus和植物寄生线虫B．xylophilus有着很高的侵染率，几乎100%的供试线虫在8～10 d内死亡。

曾显雄［23］通过电镜和光镜对E．vermicola的侵染过程进行了详细的观察和描述，发现该菌株瓶梗形分生孢子梗上的半月型粘性孢子，具有内生孢子，孢子上略为凹陷的1侧具有粘液层，可粘附在经过的线虫体表上。约18 h后孢子萌发，其内生孢子产生侵入钉穿透线虫体壁，形成节状同化菌丝，利用线虫体内营养进行营养生长。线虫被侵染约48 h后，即濒临死亡。菌丝突破线虫体表直接产孢，或形成营养菌丝，向外生长再产生粘性孢子，并可粘着其他线虫。

3 E．vermicola与松材线虫关系的研究

Wang等［13］室内实验证明E．vermicolaCNU 120806对松材线虫有着非常高的侵染率，几乎100%的供试线虫在3～10 d内全部被杀死［12－13］，在大棚条件下，还发现E．vermicola可以有效地降低松萎蔫病病死木中的线虫虫口密度，并且在一定程度上控制松萎蔫病，提高松苗的存活率。将E．vermicola与灰葡萄孢的孢子液注入松萎蔫病死木中，结果表明，与未处理的对照相比，高浓度的E．vermicola孢子液可以降低病木中约79%的线虫量，而灰葡萄孢则提高了约23%的线虫量。在大棚条件下，该菌株能够在4年生的日本赤松（P．densiflora）松苗体内定殖并显著提高松苗的抗病能力。赤松苗表面预先喷洒高浓度的E．vermicola孢子液，再接种松材线虫，松苗的存活指数提高至0.67，而未处理的对照仅为0.06［19］，同时，Wang等［11，17］还证实了CNU120806对松材线虫有着强烈的吸引作用，吸引效果次之的是捕食线虫真菌环捕节丛孢（A．Brochopaga）和灰葡萄孢菌（B．cinerea）。E．vermicola的活菌丝对琼脂平板上的线虫，已发病枯萎的松树木段以及接种线虫15 d和30 d的松苗里的松材线虫均有着强烈的吸引效果。同时还发现活菌丝的气体挥发物，对已接种线虫15 d和30 d的松树苗里的松材线虫也有着吸引效果。这对松萎蔫病的生物防治提供了新的实验依据。林间研究结果表明，E．vermicola可以存活在由松树分泌的树脂和其他化学品中，并繁殖新月分生孢子侵染其他松材线虫。为了确定其致病性，对松苗和大松树分别接种300 μL和40 mL的该菌株的孢子悬浮液（109／mL）。结果表明，各处理的松树是健康的，与对照组比较无差异，此外，木材切片观察结果表明，没有出现由真菌引起坏死或变色［19］。

E．vermicola吸引线虫的物质包括挥发性物质（volatile diffusing compounds）和非挥发性分泌物（avolatile exudative）。当其粘性孢子粘附到线虫体表时，大多集中在线虫头部，也就是许多化学感受器所在的部位。因此松材线虫可能对E．vermicola的菌丝和孢子有化学趋向性，这也是该菌株获取线虫作为营养的一种有效的方式［13］。作者［14］试验证明了E．vermicola分泌挥发性有机化合物对松材线虫具引诱作用，并确定了这些活性化合物为常见的松树挥发物：α－蒎烯，β－蒎烯，和樟脑。但非挥发性分泌物及其生物活性仍待研究。

4 E．vermicola在松萎蔫病生物防治中的应用前景

松萎蔫病被认为是一个全球性的对松树林威胁病害，会造成巨大的经济损失和负面的生态后果。了解感染过程及所有相关因素，为制定控制松材线虫防治策略已成为几个大洲的共同目标［24］。在植物线虫的生物防治中，捕食线虫真菌一直被认为是有前途的生物制剂［25－28］。

E．vermicola为至今唯一被报道的可在松树寄主内建立种群的松材线虫内生真菌。其新月形分生孢子能黏附松材线虫的表皮角质层，导致感染并使线虫死亡并从线虫的尸体内长出新的分生孢子，再进入下一侵染循环。目前的研究已经证明其作为松萎蔫病生物防治的巨大潜力［12－15，17－20］：（1）该菌株对松材线虫具高侵染率和致死率；（2）除了几种线虫，它不影响其他生物；（3）对寄主松树是无毒的；（4）特殊形状的分生孢子易与其他真菌区分，有利于在松树体内群体的动态跟踪；（5）该菌株从自然界中分离，不增加环境污染。

但是，上述试验多数在温室或运用小苗进行试验，林间的推广将遇到更复杂的情况，例如风、雨、紫外线照射、温度、湿度等很多因素和其他真菌可能会影响其萌发与定殖。因此，仍需大量的研究以探明E．vermicola与线虫，乃至寄主植物的互作机理。目前，作者［14］报道了其吸引松材线虫的挥发性物质，并建立了一种简易、灵敏的“硅胶管”生测方法，为其他挥发性活性物质及非挥发性物质的研究打下了基础。

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Review on the endoparasitic fungus Esteya vermicola

LIN Feng1，YE Jian-ling2，ZHAO Bo-guang3*
（1.Advanced Analysis and Testing Center，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China；2.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210013，China；3.College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）

We introduced the discovery，identification，classification and main morphological characteristics of pine wood nematode（PWN）endoparasitic fungus（Esteya vermicola）in this paper，the interaction betweenEstega vermicolaand PWN was briefly discussed，its application in biological control in pine wilt disease was reviewed.

Bursaphelenchus xylophilus；Esteya vermicola；Endoparasitic fungus

S763

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.02.013

1001－7380（2014）02－0050－04

2014-02-11；

2014-02-21

林 峰（1979－），女，福建莆田人，实验员，主要研究方向：松萎蔫病致病机理的研究。

*通信作者：赵博光（1944－），男，教授，硕士，主要从事森林保护学的研究与教学工作，E-mail：zhbg＠nifu.edu.cn。