鹿茸多肽诱导心肌干细胞分化作用及对心肌细胞特征性MHC基因表达的影响

李朝政,许佳明,王 烨,吕昌亮,张海婷,段 青,黄晓巍*

(1.长春中医药大学,长春 130117;2.中国中医科学院,北京 100700)

心脏疾病的发生多数伴有心肌细胞损伤，而维持心肌细胞数目是心肌损伤修复的关键，体内自身的潜能干细胞向心肌细胞分化可能是实现受损心肌组织靶向修复的重要途径。心肌干细胞和骨髓间充质干细胞是最具心肌分化潜能的干细胞。心肌损伤时，这些干细胞可以被激活，并迅速向损伤处迁移，分化为成熟的心肌细胞，通过靶向修复增加心肌细胞的数量。鹿茸多肽是从新鲜鹿茸中提取的一类多肽类物质，具较强的生物活性，鹿茸多肽对骨组织、神经纤维损伤的修复有明显的促进作用。对损伤后期心肌修复具有明显的促进作用，其作用机制可能通过诱导干细胞定向分化心肌细胞参与心肌损伤的靶向修复。为此，本研究针对体外培养的心肌细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察鹿茸多肽对诱导前后心肌细胞特征性基因α-心肌肌球蛋白重链(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重链(β-MHC)的表达的影响，探讨鹿茸多肽对心肌干细胞分化的促进作用及机制。

1 实验材料

新生SD大鼠，清洁级，由吉林大学动物实验研究中心提供。鹿茸多肽，长春中医药大学附属医院实验中心提供。Trizol试剂(美国Life Technologics)，逆转录试剂盒(北京鼎国生物技术公司)，PCR引物(上海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(瑞士Fluka公司),胶原酶Ⅱ(美国sigma公司)，胎牛血清。

DL-2000 Marker(日本Takara生物工程公司),GeneAmp PCR System 2700(日本Takara生物工程公司)，Biofuge primo R低温离心机(德国Heraeus公司)，WD-9403C紫外分析仪(北京市六一仪器厂)，VDS凝胶成像系统(瑞典Pharmacia公司)，胎牛血清(瑞士Fluka公司)。

2 实验方法

2.1 大鼠心肌干细胞分离和生物学特性鉴定[1]

2.1.1 心肌干细胞的获取 取出生后第2天的新生鼠，断颈后置于75%的乙醇内消毒30 s,在无菌条件下取整个心脏置于直径为3.5 cm培养皿中剪成大约1 mm3的小块状心肌组织，用不含钙磷的PBS液冲洗心肌组织碎块至液体澄清。然后加入0.25%胰酶2 mL消化5 min后吸出消化液，加入0.1% Ⅱ型胶原酶2 mL，消化5 min，弃去消化液。上述交替消化过程重复3次后，向心肌组织碎块加入完全培养液,洗2次后，将心肌组织碎块移入25 cm2培养瓶中，尽量在瓶底均匀铺开，上述操作均在25 ℃室温下完成。然后加入少量CEM培养液约1 mL，放入37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养12 h，加入4 mL CEM培养液继续培养，为原代培养。1个心脏所得到的组织碎块种植于1个培养瓶中。每3 d换液1次，并在倒置显微镜下逐日观察细胞生长情况。

2.1.2 心肌干细胞的传代 10 d左右细胞增殖铺满培养瓶底,即可进行传代。吸取并弃去培养瓶中培养液，用PBS液洗2次，加入0.25%胰酶1 mL消化2～3 min，镜下可见细胞收缩变圆，立即加入10 mL CEM培养液终止反应，并反复用吸管吸取瓶底液体吹打培养瓶底壁，使附壁细胞脱落形成细胞液，将细胞液移至15 mL离心管,1 000 r/min离心5 min。弃去上清并重新加入CEM培养液10 mL，按1∶2传代的比例分成2个培养瓶继续培养。传代后的细胞3 d换液1次。

2.1.3 流式细胞仪鉴定 取P0代细胞制成细胞悬液，取100 μL细胞液加入2 μL CD特异性检测用单克隆抗体冰上孵育30 min，用PBS/Azide液1 mL洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，共用PBS液洗2次。然后加入100 μL PBS/Azide液及100 μL 2%多聚甲醛，摇匀后立即送流式细胞仪检测。

2.1.4 细胞形态 心肌组织碎块植入培养瓶后,2～3 d后可见有细胞自心肌组织碎块的边缘移出，并沿着组织碎块的周围呈同心圆向外围生长。原代及P1代细胞常有杂质细胞，其形状及大小与心肌干细胞明显不同，但经过传代至P3及P4代时，这些细胞就会死亡和消失，得到的是较纯的CSCs。P1代细胞及之后的传代细胞的生长类似于骨髓间充质干细胞的同心圆状生长。在用CEM不断传代的过程中，未见有干细胞向搏动的心肌细胞的分化,一直保持干细胞旺盛的分裂和增殖的特征。鉴定心肌干细胞所采用的主要方法是通过流式细胞仪检测其表面标志。选取了c-kit，CD29，CD90，CD34，CD45对所培养出来的P0代心肌干细胞的特征进行了流式细胞仪检测，结果显示这些CSCs其c-kit，CD29，CD90为阳性，CD44，CD45为阴性。

2.2 鹿茸多肽诱导及条件培养基制备 将P3代CSCs用胰酶消化后，制成细胞悬液,用CEM培养液调节细胞浓度为105/mL，分别接种到50 mL塑料培养瓶中和孔内放有载玻片的6孔细胞培养板中，共接种7瓶和2块6孔细胞培养板。待细胞贴壁后，加不同浓度(50,100,200,400,800,1 600 μg/mL)鹿茸多肽进行体外诱导实验。每隔2～3 d换1次培养液，连续诱导培养3周。其中6孔细胞培养板接种的细胞用于免疫组化染色,另外7瓶用于RT-PCR分析。诱导培养3周后，用细胞刷收集用于RT-PCR分析的细胞，液氮中保存备用；用镊子取出用于免疫组化染色瓶内的载玻片，用各种抗体进行免疫组化染色。

2.3 RT-PCR分析鹿茸多肽对HMC基因表达影响 将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平。

2.3.1 PCR引物序列 β-MHC，sense:5’-caagggcctgtgctacta-3’，antisense:5’-gaccgtgtccagctcg-3’，扩增片段大小196bp。α-MHC，sense:5’-ccggagtattgggaggag-3’，antisense:5’-ggatggtgtgagagcgg-3’，扩增片段大小118bp。GAPDH1，sense:5’-gttaccagggctgccttc -3’，antisense:5’-gatgaccagcttcccatt-3’，扩增片段大小156bp。GAPDH 2，sense:5’-gttaccagggctgccttc -3’，antisense:5’-cccttcaggtgagcccca-3’,扩增片段大小290 bp。以上引物均由上海生工生物技术有限公司合成。1)按引物合成单上所给引物的量，将所有引物均稀释成10 pmol/L后,-20 ℃冰箱保存备用。2)75%乙醇：量取无水乙醇75 mL，加DEPC处理过的水25 mL，混合后使用。3)PBS：在800 mL蒸馏水中溶解8 g NaCl、0.2 g KCl和3 g Tris碱，加入0.015 g酚并用HCl调至pH值至7.4,用蒸馏水定容至1 L，分装后在121磅高压下蒸汽灭菌20 min，于室温保存。4)TBE:pH8.5，0.08 mol/L Tris-HCl；0.08 mol/L硼酸；0.002 4 mol/L EDTA。5)上样缓冲液:溶解于TBE内的样品应含指示染料0.025%溴酚蓝、10%甘油即可。6)EB：在100 mL水中加入1 g溴化乙锭，装入棕色瓶中，室温保存。

2.3.2 实验操作过程 按照Trizol试剂盒说明提取脑内总RNA。然后进行逆转录，再进行PCR反应，具体操作过程如下。1)总RNA制备和鉴定。①取不同浓度诱导的细胞各1瓶,用细胞刷收集细胞于15 mL离心管中，1 500 r/min离心后，将细胞沉淀转移到1.5 mL EP管中。②每管加Trizol试剂1 mL，用无RNA酶玻璃匀浆器将组织匀浆，室温下放置10 min,按照生产商提供的说明提取组织总RNA。③将组织裂解液转移至对应的离心管中,并用吸管反复吹打直至裂解液中无明显沉淀,在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。④向上述得到的各组裂解液中各加入氯仿0.3 mL后,振荡15 s，至粉红色浑浊液无分层现象，室温静置3 min。⑤12，000×g，4 ℃，离心15 min。⑥取出离心管，样品分为3层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相的体积约为所用Trizol试剂的60%。⑦向上清水相中加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min。⑧12,000×g，4 ℃，离心10 min；⑨小心去除上清，缓慢沿管壁加入1 mL 75%的乙醇，轻轻混匀。⑩同上12，000×g，4 ℃，离心10 min；小心吸尽上清，室温干燥沉淀2～5 min，每管加入50 μL的无RNase水溶解RNA沉淀,待完全溶解后于- 70 ℃保存；吸取RNA 样品各5 μL，加载到1%琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色分析提取细胞总RNA的纯度；分别吸取RNA样品各5 μL用1×TE Buffer稀释样品100倍,测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的含量，稀释成1 μg/μL备用。RNA的浓度=OD260×稀释倍数×0.04 μg/μL。OD260/280在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度符合要求。2)逆转录反应将RNA逆转录为cDNA。按GenAmp RNA PCR试剂盒操作说明，制备的cDNA溶液。具体操作略。3)PCR反应。①将上、下游引物用无RNase无菌水稀释为10p mol/L，按本PCR反应体系加入下列溶液到0.2 mL EP管中。②先94 ℃预变性5 min。③然后94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min。完成35个循环。④最后72 ℃延伸10 min。3)产物分析。①称取琼脂糖粉末0.5 g，加TAE缓冲液50 mL,微波炉加热使之融化，冷至55 ℃时加入溴化乙锭(EB,5 mg/mL)5 μL至终浓度为0.5 μg/mL，然后将其注入到胶模子中，放好样品槽梳子，梳齿下端距玻璃板约0.5 mm,待胶凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1 mm处。②样品制备与加样：吸取待测PCR扩增产物10 μL，加6×样品缓冲液2 μL，混合后，分别加到各上样孔内。③打开电泳仪电源，调节电压为10 V/cm。在低温条件下电泳30 min。④电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，通过凝胶成像系统进行拍照，记录结果。4)鹿茸多肽对CSCs细胞β-MHC和α-MHC基因的表达检测分析。利用RT-PCR方法对β-MHC和α-MHC基因的表达情况进行检测分析，用GAPDH为内标基因。对加不同浓度(50,100,200,400,800,1 600 μg/mL)鹿茸多肽体外诱导的条件培养细胞样本进行实验测定，采用凝胶成像系统对RT-PCR扩增产物电泳结果进行紫外扫描分析,根据β-MHC和α-MHC基因与内参基因GAPDH的比值大小判断鹿茸多肽的调节作用。

3 实验结果

3.1 传代培养CSCs细胞的形态学变化的比较 心肌细胞经过3代的传代培养,细胞得到了纯化。到第3代，从形态上判断心肌干细胞的纯度在95%以上。

3.2 鹿茸多肽对CSCs 分化心肌细胞特征性基因MHC表达的影响 实验结果表明，鹿茸多肽对CSCs细胞MHC基因表达有一定的调节作用,在一定范围内存在量效关系。随着鹿茸多肽浓度的增加，β-MHC和α-MHC基因的表达均有所增加。

4 讨论

研究发现，在受损心肌内有大量的处于有丝分裂期的细胞，这提示心肌细胞不但能够自身分裂、再生，而且还有新的细胞参与，说明心肌本身存在一种自然修复机制，并通过相关机制实现心肌细胞的自我更新[2],Kajstura等利用共聚焦显微镜检查对照组成人心脏，发现约有1.4×107个细胞在发生有丝分裂。心肌细胞更新率在25岁时为1%，在75岁时为0.45%，正常人一生有<50%的心肌细胞更新过[3-4]。基于对成体干细胞发育潜能的重新认识，使干细胞靶向修复心肌细胞损伤的研究已成为当前心血管病研究领域的热点。成体心肌干细胞(CSCs)是成熟机体的心脏组织中存在的，具有高度自我更新能力和特异性心肌分化潜能的干细胞，CSCs是目前被认为最有希望以完全心肌再生靶向修复缺血性心肌损伤的干细胞类型。心肌受到损伤刺激后，CSCs可以在心肌损伤局部激活、并迅速向损伤处迁移，分化为成熟的心肌细胞，通过靶向修复增加心肌细胞的数量。如何激活自身CSCs，促进其在体内向心细胞转分化等都是亟待解决的问题。到目前为止,5-氮胞苷是诱导分化成心肌细胞的唯一有效化学制剂，中药提取成分对心肌干细胞分化有促进作用有报导，廖联明等研究发现黄芪甲苷对心肌干细胞分化的促进作用[5],中药淫羊藿的有效成分淫羊藿苷具有诱导分化干细胞的作用[7]。心肌细胞是一种高度分化的终末细胞，其收缩蛋白以α-肌球蛋白(α-MHC)为主，主管收缩功能。收缩蛋白包括肌球蛋白,肌动蛋白、向肌球蛋白及向宁蛋白。其中肌球蛋白包括2个重链(MHC)、2个轻链(MLC),心肌仅有2种MHC基因表达即α-MHC和β-MHC。因此α-心肌肌球蛋白重链(α-MHC)和β心肌肌球蛋白重链(α-MHC)可认为是心肌细胞特征性基因。干细胞向心肌细胞分化时可表达相关基因和产生相关的蛋白作为标志，MHC是心肌特异表达蛋白之一。其表达水平可以作为实验观察指标,反映干细胞向心肌细胞分化的情况。

本研究主要通过CSCs的体外培养，并在培养过程中加入不同浓度的鹿茸多肽做为生物诱导剂,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察了鹿茸多肽诱导对CSCs细胞特征性基因α-心肌肌球蛋白重链(α-MHC)和β心肌肌球蛋白重链(α-MHC)的表达影响，结果表明，鹿茸多肽对CSCs细胞MHC基因表达有一定的调节作用，在一定范围内存在量效关系,随着鹿茸多肽浓度的增加，β-MHC和α-MHC基因的表达均有所增加，提示鹿茸多肽有成为诱导CSCs分化成心肌细胞生物诱导剂的潜在可能。其相关研究有待于进一步深入。

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[5]廖联明,郑友生,江敏,等.黄芪甲苷促进心肌干细胞分化的作用研究[J].中华细胞与干细胞杂志,2011,1(1):52-56.

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