益气解毒方对体外培养小鼠肝癌H22细胞生长的抑制作用

王 微,马立斌,尚云龙,董燕飞,李洪禹,葛学萍,孟令玉,韩泽华,王冰梅*

(1.长春中医药大学基础医学院生理教研室，长春 130117；2.长春中医药大学临床医学院，长春 130117；3.长春中医药大学药学院，长春 130117)

本实验通过制备益气解毒中药复方含药血清，研究其体外抗小鼠肝癌H22细胞生长的作用。

1 实验材料

小鼠肝癌H-22细胞株,购自吉林省肿瘤研究所。SD大鼠，由吉林大学实验动物中心提供。益气解毒方由我校附属医院临床验方加减而成：黄芪、当归、丹参、鳖甲、菊花、半枝莲等，经过水煎醇沉处理，制成浓度1.25 g生药/mL的药液备用。化疗阳性药：5-氟尿嘧啶(5-FU)由上海旭东海普药业有限公司生产。标准胎牛血清(Fetal Serum Bovine，FBS)，Hyclone公司产品；RPMI-1640完全培养基干粉：美国Gibco公司产品；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-(2，5)-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝,MTT):美国Sigma公司产品；二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide DMSO)：Amresco公司产品；台盼蓝，青霉素，链霉素。其他常规化学试剂均为进口或国产分析纯产品。二氧化碳培养箱，Heraeus Hera Cell-150型，德国；研究用倒置显微镜，OLIMPUS IX-70，日本；全自动酶标仪，Bio-Rad680型，美国；超净工作台，苏州净化设备厂；低速离心机，上海飞鸽。

2 实验方法

2.1 细胞培养 小鼠肝癌H22细胞以台盼蓝计数法显微镜下计数，加入含10%FBS的RPMI-1640培养液，调整细胞数为5×105/mL接种于培养瓶中。置二氧化碳培养箱内(5%CO2，37 ℃)中静置培养，待培养液变为橙色时更换培养基，以1 000 r/min速度离心5 min，弃上清，再以RPMI-1640培养液重悬细胞，继续培养。待细胞生长至数量较多时，离心后，分瓶培养，传代。

2.2 大鼠含药血清的制备 取健康大鼠10只，雌雄不限，体质量180～220 g。每天禁食10～12 h后，按“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”[1]，人与大鼠的等效剂量比值56.0换算，每日应以1.25 g生药/mL的浓度按10 mL/kg体质量的剂量灌胃给予中药提取液益气解毒方。采用血清药理实验中的通法方案[2],给药方式为每日分2次给药，间隔10～12 h。连续灌胃给药3 d后，于末次给药后1 h，20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，无菌条件下腹主动脉采血，4 ℃静置2 h，1 500 r/min离心15 min，10 min后取血清，56 ℃，30 min灭活，分装，-20 ℃冰箱保存备用[3]。 另取健康大鼠5只，连续3 d每日给予等量生理盐水灌胃，于末次灌胃后1 h采血，处理同上，制备对照组血清，分装，-20 ℃冰箱保存备用。

2.3 MTT法检测益气解毒方对体外培养小鼠肝癌H22细胞增殖的抑制作用 收集处于对数生长期细胞，台盼蓝计数法镜下计数，用RPIM-1640培养液调整细胞悬液浓度，稀释细胞浓度至5×105个/mL，取96孔板，每孔加入190 μL细胞。置37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养24 h。将培养板中的细胞分为阴性对照组、阳性对照组和给药组。阴性对照组加不含药血清10 μL；阳性对照组加50 μmol/L的5-FU 10 μL;给药组分别加入2.5%、5%、10%、20%的含药血清(均为10 μL)，各组各剂量均设8个平行孔。 加药培养44 h后，取出培养板，在超净台内每孔加入20 μL MTT溶液,放回培养箱，37 ℃继续培养4 h。 取出培养板，小心吸出各孔培养液上清，加入DMSO 150 μL，置于酶标仪中振荡10 min，使结晶物充分溶解，以570 nm波长测各孔吸光值，各平行孔的吸光值取平均值(A)，根据A值计算H22细胞的生长抑制率。

3 结果

3.1 益气解毒方含药血清对体外培养的小鼠肝癌H22细胞的生长状态及形态的影响 于倒置显微镜下每日对体外培养H22细胞的形态进行观察发现，各浓度的益气解毒方含药血清均对H22细胞有抑制作用。培养24 h后，各组细胞饱满圆润，大小均一，表面光滑，核分裂相增多，细胞折光性好，培养液较为清澈，极少见细胞碎片；继续培养48 h后，阴性对照组细胞增殖明显，几乎铺满整个培养孔，极少见细胞碎片。加药培养48 h后，给药组与对照组比较，细胞数量减少，细胞大小不一，死亡细胞增多，细胞膜表面略显粗糙，折光性差，胞浆内颗粒增多、增粗，培养液中悬浮较多细胞碎片。

3.2 益气解毒方含药血清对体外培养小鼠肝癌H22细胞增殖的抑制作用 见表1。

表1 益气解毒方含药血清加药培养24、48 h后对H22细胞增殖的抑制作用(n=8)

注：与阴性对照组，###P<0.001，##P<0.01。

4 小结

中医学认为肝癌的发病原因主要与机体的正虚邪实[4]、气滞血瘀、湿毒凝聚有关[5]。故而临床上多采用益气扶正[6-8]、活血散结[9]的中药复方进行治疗。

本研究以中医理论为基础[10]，根据临床经方配伍，采用补益类药物佐以清热解毒、活血散结之中药，确立了经黄芪、当归、丹参、鳖甲、菊花、半枝莲等中药为主的益气解毒方。通过血清药理学实验研究表明，该中药复方对体外培养的小鼠肝癌H22细胞的生长有明显的抑制作用,且这种抑瘤作用呈现出时间、浓度依赖性，其体内抗肿瘤作用效果及抗肿瘤作用机制有进一步研究的意义。

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