电化学发光法检测血清神经元特异性烯醇化酶的方法学性能验证

张凯，刘鹭，程建平，金跃，张建明

（淮安市第二人民医院检验科，江苏淮安223002）

电化学发光法检测血清神经元特异性烯醇化酶的方法学性能验证

张凯，刘鹭，程建平，金跃，张建明

（淮安市第二人民医院检验科，江苏淮安223002）

目的：建立电化学发光法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）检测神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）方法学性能验证的方案。方法：应用美国临床实验室标准化协会（CLSI）文件推荐的方法，通过罗氏Cobas E601免疫分析系统检测血清NSE值，对其准确度、精密度、分析测量范围、分析灵敏度和生物参考范围进行性能验证。结果：NSE准确度以相对偏倚表示，为2%～4%，批内变异系数＜1．0%，批间变异系数＜2．5%，分析灵敏度＜0．05 ng／mL，分析测量范围为1．01～351．00 ng／mL，参考范围为0．0～16．7 ng／mL。结论：ECLIA法检测血清NSE性能参数和厂商声明一致，其性能可以满足临床要求，验证方案简便易行。

电化学发光；神经元特异性烯醇化酶；方法学验证

国际标准化组织（ISO）于2003年颁布了《医学实验室质量和能力的专用要求》（ISO 15189）作为医学实验室认可的标准，要求实验室应对设备、检测系统或者方法的主要分析性能进行验证或确认，证实其能够达到所要求的性能标准。《医疗机构临床实验室管理办法》也明确提出，临床实验室应进行恰当的方法学验证以保证各项参数符合临床使用需求。血清神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）是我科应用罗氏Cobas E601免疫分析系统的电化学发光法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）检测的新项目，根据ISO 15189医学实验室认可标准、美国《临床实验室改进法规修正案》（CLIA′88）、卫生部《三级综合医院评审标准实施细则》、《医院检验科管理规范》等管理文件要求，检测分析系统在应用于临床实验室之前，必须对其主要的分析性能包括变异系数（CV，即不精密度）、不准确度（偏倚）、分析测量范围、分析灵敏度和生物参考范围等主要指标进行验证。因此，我科对其进行了多项参数验证，现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料1．1．1 仪器与试剂 Cobas E601全自动化学发光分析仪（瑞士罗氏公司），罗氏配套试剂（链霉亲和素包被的微粒、生物素化抗NSE单克隆抗体、三联吡啶钌标记的抗NSE单克隆抗体）、校准品以及质控品。

1．1．2 标本 高或低浓度NSE血清样本来自我院常规检测患者，参考范围验证所用血清样本来自我院健康体检者（血常规和常规生化体检结果正常），男、女各20例，平均年龄（35．5±6．8）岁，其中女性排除月经和妊娠，所有标本均无溶血，收集时间为2014年3月。

1．2 方法

1．2．1 样本检测 按Cobas E601操作规程对仪器进行系统维护保养，室内质控检测结果在控后，按项目说明书要求收集空腹静脉血液并分离血清，将血清与质控品、校准品或样本稀释液等按检测程序进行检测。

1．2．2 准确度验证 参考美国临床实验室标准化协会（clinical and laboratory standards institute，CLSI）EP9-A2文件，用罗氏校准品（LOT：00169337，浓度为11．3 ng／mL和82．0 ng／mL），先对分析系统进行常规校准；再按程序检测校准品，重复检测3次求平均值，将所得验证值与靶值进行比对，计算二者间的相对偏倚，如偏倚在±20%之内则验证合格［1］。1．2．3 精密度验证 参考EP5-A文件，选择罗氏公司的质控血清（PC TM1：LOT 16995700；PC TM2：LOT 16995800）作为精密度验证样本，按NSE样本检测程序进行测定，每天重复3次，持续5 d，进行批内与批间精密度验证，计算均值、标准差（s）和变异系数［2］。批内标准差（Sr）和批间标准差（Sb）D是总天数（即5 d），d是每天测定结果的平均值，n是每天重复测定总次数（即3次），i是次数，1次，2次或3次是每天重复测定的结果，是每天所有检测结果的平均值是所有5天的和除以总的天数。

1．2．4 分析测量范围（analyticalmeasurement range，AMR）验证 按CLSI EP6-A2文件，选择2份检测NSE的患者血清，分别为低浓度（L，1．01 ng／mL）和高浓度（H，351．0 ng／mL），按5L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、5H的比例关系配制成6份不同浓度的混合血清，每份血清重复检测3次取平均值，对6份系列浓度混合血清样本的检测平均值与预期值进行多项式回归统计，比较实测值（Y）与预期值（X），计算回归方程后确定NSE的线性范围［3］。

1．2．5 分析灵敏度验证 参考文献［4］，以Elecsys通用稀释液作为空白样品测定20次，记录每次发光强度值和浓度值，如超过空白检测限（Limit of blank，LoB）的值不超过3个，则给出的LoB值可用［4］。

1．2．6 生物参考范围验证 采集2014年3月在我院体检中心体检者（常规生化与血常规体检均正常）空腹血清，男女各20例，按检测程序进行检测，要求不超过10%数据（即不多于4个）在厂商给的生物参考范围之外，否则NSE的生物参考范围需重新建立［5］。

1．3 统计分析

准确度、精密度验证数据计算与处理采用Office 2010 Excel软件。AMR验证应用SPSS 18．0软件统计分析处理，采用多项式回归分析法，回归系数用bi表示，一次、二次、三次回归分析方程分别为Y＝b0＋b1X、Y＝b0＋b1X＋b2X2、Y＝b0＋b1X＋b2X2＋b3X3，其中b2和b3为非线性系数斜率，计算bi的标准差SEi，然后行t检验判断b2和b3与0之间差异有无统计学意义，如差异无统计学意义，则预期值与实测值关系为线性。

2 结果

2．1 准确度验证结果

与罗氏NSE校准品相比，准确度验证的2份校准品检测结果的偏倚分别是2．02%和3．72%，都在±20%范围内，符合相关文件的要求。见表1。

2．2 精密度验证结果

结果显示，2份质控品批内CV分别为0．81%和0．91%，批间CV分别为2．4%和2．3%，均符合罗氏公司的NSE项目说明书参数（≤10%）。见表2。

2．3 AMR验证结果

经多项式回归分析得到b2＝5．4×10－6，b3＝4．4×10－7，经t检验与0比较，P均＞0．05，说明二者与0差异无统计学意义，所以预期值与实测值间为线性关系，线性方程为Y＝0．204＋1．001 2X（F＝145 724，P＜0．001）；截距b0与0比较差异无统计学意义（t＝0．733，P＞0．05）；斜率b1与0比较，差异有统计学意义（t＝381．7，P＜0．001），说明预期值与实测值间有真实的线性关系。故本次实验的线性范围在1．01～351．00 ng／mL之间。见表3。

2．4 分析灵敏度验证结果

结果显示，没有超过LoB值（＜0．05 ng／mL）的数值，说明厂商提供的参数（＜0．05 ng／mL）可用。

2．5 生物参考范围验证结果

结果显示，有2例检测结果超过范围（分别为18．52 ng／mL和20．21 ng／mL），其余结果均为0～16．7 ng／mL，在厂商提供的参考范围之内，说明该NSE参考范围可以接受。

3 讨论

NSE是一种参与糖酵解途径的烯醇化酶，在神经组织和神经内分泌组织细胞以及其所引发的肿瘤细胞中呈高表达。NSE可作为监测小细胞肺癌的首选标志物，与临床疾病进展有良好的相关性。神经母细胞瘤和精原细胞瘤中NSE浓度明显增加［6］。

准确度通常由对定值的质控品或校准品进行检测并计算偏倚，或与参考检测系统以及其他标准方法进行方法比对和偏倚评估来确定。本文先对E601发光仪进行校准；再检测校准品，将检测结果与靶值进行比对，计算二者间相对偏倚，结果显示2份校准品与靶值的偏倚均在美国《临床实验室改进法规修正案》（CLIA’88）允许误差范围内。精密度是进行方法学性能验证的前提，是一个反映检测系统整体性能的指标，是指检测系统在特定条件下，多个独立的测试结果间的一致程度。本研究参考CLSIEP5-A文件以2个浓度水平罗氏质控品为实验样本，最后得到批内和批间变异系数，方法简便易行，适合于普通临床实验室应用。

AMR是指患者样本未经稀释和浓缩等任何预处理，由检测方法获得的测定值范围［7］。经过本次验证，E601分析系统在我室测定NSE的AMR与厂商说明书提供的相近；分析灵敏度验证结果也和厂商提供数据一致；40份健康体检者样本血清中NSE浓度除2例偏高外，均在仪器说明书的参考范围之内，按照CLSIC28-A文件的要求，可以直接使用厂商提供的参考范围。

目前国内尚没有ECLIA法检测NSE方法学性能验证方面的报道，所以本研究对Cobas E601检测系统测定血清NSE的一些方法学性能进行验证，验证结果与厂商提供的性能指标基本一致，为临床实验室应用该项目提供了准确和可靠的依据，对于规范定量免疫检验，提高检验质量有着重要意义。因实验成本和其他客观因素，本研究尚有许多缺陷，如验证生物参考范围用的样本例数较少，目前江苏省NSE尚不是室间质评项目而无法将其用于准确度验证中，我们将在下一步实验中加以完善。

［1］ CLSI．EP09-A2-IR．Method comparison and bias estimation using patient sample；approved guideline-second edition［S］．PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2002．

［2］ NCCLS．EP15-A．User demonstration of performance for precision and accuracy；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2001．

［3］ NCCLS．EP6-A．Evaluation of the linearity of quantitativemeasurement procedures：a statistical approach；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2003．

［4］ NCCLS．EP17-A．Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2004．

［5］ NCCLS．C28-A2．How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory：second edition［S］．Pennsylvania：USA，2000．

［6］ Załęska M，Szturmowicz M，Zych J，etal．Elevated serum NSE level in locally advanced and metastatic NSCLC predispose to better response to chemotherapy but worse survival［J］．Pneumonol Alergol Pol，2010，78（1）：14－20．

［7］ 许斌．医院检验科建设管理规范［M］．2版．南京：东南大学出版社，2013：235．

R446．69

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1671－7783（2014）05－0455－03

10．13312／j．issn．1671-7783．y140175

2014－06－22 ［编辑］ 刘星星