咳喘颗粒剂对热型哮喘患儿外周血Th1／Th2细胞的影响

王海生，王武强，刘小林，薛建华，吴玉芳，马梅香

（常州市武进中医医院1．检验科；2．中医儿科，江苏常州213161）

咳喘颗粒剂对热型哮喘患儿外周血Th1／Th2细胞的影响

王海生1，王武强2，刘小林1，薛建华1，吴玉芳1，马梅香1

（常州市武进中医医院1．检验科；2．中医儿科，江苏常州213161）

目的：探讨咳喘颗粒剂对热型哮喘患儿外周血Th1／Th2细胞的作用。方法：48例热型哮喘患儿随机分为颗粒组和常规组，各24例；常规组口服中药咳喘颗粒剂，3次／d，3 d为1个疗程，治疗2个疗程；常规组采用常规西药治疗，布地奈德粉吸入剂（100μg／吸）和硫酸特布他林气雾剂（0．25 mg／喷），2次／d，治疗1周；另取20名健康儿童作为对照组。实时定量PCR检测各组外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中T细胞表达的T盒（T-box expressed in T cells，T-bet）mRNA和GATA连接蛋白3（GATA binding-3，GATA-3）mRNA的表达；ELISA法检测各组血浆IFN-γ和IL-4水平。结果：颗粒组和常规组总有效率分别为95．83%、91．67%，差异无统计学意义（χ2＝0．559，P＞0．05）。治疗前，颗粒组和常规组GATA-3 mRNA和IL-4水平明显高于对照组（P＜0．01），T-betmRNA和IFN-γ水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05），而T-betmRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4明显低于对照组（P＜0．01）。治疗后，3组GATA-3 mRNA、T-betmRNA、IL-4、IFN-γ水平及T-betmRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4比值比较，差异均无统计学意义（P均＞0．05）；但与治疗前相比，颗粒组和常规组GATA-3 mRNA和IL-4水平明显降低（P＜0．01），T-betmRNA／GATA-3mRNA和IFN-γ／IL-4明显升高（P＜0．01），T-betmRNA和IFN-γ表达仅轻度增加（P＞0．05）。结论：咳喘颗粒剂通过抑制Th2细胞，纠正Th1／Th2细胞平衡治疗患儿热型哮喘。

咳喘颗粒剂；热型哮喘；儿童；Th1细胞；Th2细胞

支气管哮喘是儿科的常见病和多发病，免疫学研究表明，机体Th1／Th2细胞失衡，Th2细胞极化所引起的局部嗜酸性粒细胞浸润和气道高反应性是其发病重要机制［1］。咳喘颗粒剂是我院名老中医经验方，临床用于治疗儿童热型哮喘达10多年，效果明显［2－3］。本研究拟以热型哮喘患儿为研究对象，检测咳喘颗粒剂治疗前后外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中Th1／Th2细胞转录因子，即T细胞表达的T盒（T-box expressed in T cells，T-bet）和GATA连接蛋白3（GATA binding-3，GATA-3）及细胞因子IL-4、IFN-γ水平的变化，探讨咳喘颗粒剂对热型哮喘患儿外周血Th1／Th2细胞的影响。

1 对象和方法

1．1 对象

选择2012年5月至2014年1月于常州市武进中医院儿科门诊就诊的热型哮喘患儿。诊断标准：符合1994年中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断与疗效标准》。纳入标准：中医属热型哮喘者；病情严重程度分级属于《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》第2～3级者；年龄4～14岁；患儿父母签署知情同意书。排除标准：合并肺部感染者；病情严重程度分级属于《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》第4级者；合并先天性心脏病或因其他原发病所致哮喘者［2］。

将符合入选条件的48例患儿随机分为2组。颗粒组24例，其中男11例，女13例，年龄4～14岁，平均（7．6±3．6）岁，病程6个月～2年。常规组24例，其中男10例，女14例，年龄5～14岁，平均（7．9±4．1）岁，病程6个月～2．5年。另选取20例健康体检儿童作对照组，其中男8例，女12例，年龄5～14岁，平均（7．3±3．5）岁。各组一般资料比较，差异均无统计学意义（P均＞0．05）。

1．2 方法

1．2．1 治疗方法 颗粒组采用中药咳喘颗粒剂治疗，其组成为蜜麻黄3 g、杏仁10 g、白前10 g、蝉蜕6 g、甘草3 g、姜半夏6 g、葶苈子10 g、地龙10 g、浙贝母10 g、川芎10 g、金荞麦15 g、鱼腥草15 g（江苏江阴天江药业有限公司），开水冲服，3次／d，3 d为1个疗程，治疗2个疗程。常规组采用常规西药吸入治疗，布地奈德粉吸入剂（AstraZeneca公司，100 μg／吸）和硫酸特布他林气雾剂（AstraZeneca公司，0．25 mg／喷），2次／d，治疗1周，1周后复诊。

1．2．2 疗效评定标准 临床控制：哮喘症状完全控制，体征消失；显效：哮喘症状明显减轻，发作次数明显减少；有效：哮喘症状减轻，仍需服药维持；无效：病情无变化或加重。

1．2．3 主要试剂和仪器 Ficoll淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司），反转录试剂盒（ToYoBo有限公司），SYBR GreenⅠ实时PCR试剂盒（杭州Bioer公司），IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒（eBioscience公司），7300荧光定量PCR仪（ABI公司），680酶标仪（Bio-Rad公司）。

1．2．4 样本处理 采集EDTA抗凝静脉血2 mL，收集血浆于－70℃保存，然后用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，加入1 mL Trizol裂解细胞，提取总RNA。总RNA先于65℃热变性5 min，然后再用反转录试剂盒合成cDNA。反转录反应体系：5×反转录反应缓冲液4μL；反转录酶混合物1μL；引物混合物1μL；总核糖核酸模板2μg；无核酸酶灭菌水补足至20μL，于PCR仪上反应，37℃15 min，98℃5 min，4℃5 min。合成的cDNA于－70℃保存备用。

1．2．5 T-bet、GATA-3 mRNA检测 利用Premier 5．0软件，根据NCBI基因库中T-bet、GATA-3mRNA保守序列设计定量PCR引物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其中T-bet：上游，5′-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3′；下游，5′-CTTG-GAAAGTAAAGATATGCGTG-3′；扩增片段129 bp。GATA-3：上游，5′-GTAGCTGTAAGGCAGAAGGATG-3′；下游，5′-ACTGGTGAACGGTAACACTGATT-3′；扩增片段279 bp。β-肌动蛋白：上游，5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′；下游，5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′；扩增片段262 bp［4］。反应体系：2× SYBR混合物12．5μL；上下游引物（10μmol／L）各0．5μL；Taq酶0．15μL；cDNA 2μL；ROX校准染料（50×）0．5μL；双蒸水补足至25μL。定量PCR反应：94℃预变性2 min；94℃10 s；60℃15 s；72℃30 s；扩增40个循环。mRNA相对表达量＝2－△CT，其中

1．2．6 IFN-γ、IL-4检测 采用ELISA法检测，严格按照eBioscience公司试剂说明书操作，经酶标仪定量。其中，IFN-γ、IL-4灵敏度分别为4 pg／mL、2 pg／mL。

1．3 统计分析

利用SPSS 15．0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差±s）表示，计数资料比较采用χ2检验，治疗前后比较采用配对t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 颗粒组与常规组临床疗效的比较

颗粒组临床控制12例，显效6例，有效5例，无效1例，总有效率95．83%；常规组临床控制11例，显效5例，有效6例，无效2例，总有效率91．67%；二组总有效率相比，差异无统计学意义（χ2＝0．559，P＞0．05）。

2．2 各组PBMC中T-betmRNA和GATA-3 mRNA水平的比较

治疗前，3组PBMC中GATA-3 mRNA表达及T-betmRNA／GATA-3 mRNA比值比较，差异均有统计学意义（F分别为41．241，50．062，P均＝0．000），T-betmRNA表达差异无统计学意义（F＝1．309，P＝0．228）。颗粒组和常规组PBMC中GATA-3 mRNA表达均明显高于对照组（P均＜0．01），而T-betmRNA／GATA-3 mRNA比值均明显低于对照组（P均＜0．01）。

治疗后，3组PBMC中GATA-3 mRNA、T-bet mRNA表达及T-betmRNA／GATA-3 mRNA比值比较，差异均无统计学意义（F分别为0．984，0．909，1．235，P分别为0．281，0．308，0．246）；但与治疗前相比，颗粒组和常规组PBMC中GATA-3 mRNA表达明显下降（P均＜0．01），T-bet mRNA／GATA-3 mRNA比值明显升高（P均＜0．01），而T-betmRNA表达差异均无统计学意义（P均＞0．05）。见表1。

2．3 各组血浆中IFN-γ和IL-4水平的比较

治疗前，3组血浆中IL-4水平及IFN-γ／IL-4比值比较，差异均有统计学意义（F值分别为52．478，73．404，P值均＝0．000），而IFN-γ水平差异无统计学意义（F＝0．824，P＝0．319）。颗粒组和常规组血浆中IL-4水平均明显高于对照组（P＜0．01），而IFN-γ／IL-4比值均明显低于对照组（P＜0．01）。

治疗后，3组血浆中IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ／IL-4比值比较，差异均无统计学意义（F分别为0．964，1．525，1．299，P分别为0．296，0．183，0．231）；但与治疗前相比，颗粒组和常规组血浆中IL-4水平均明显下降（P均＜0．01），IFN-γ／IL-4比值均明显升高（P均＜0．01），IFN-γ水平略有上升，但差异均无统计学意义（P均＞0．05）。见表2。

3 讨论

T-bet和GATA-3是控制初始T细胞分别向Th1细胞和Th2细胞转化的关键转录因子［5－6］。支气管哮喘因气道局部微环境的改变致使初始T细胞GATA-3表达增加，进而向Th2细胞转化，具体表现为Th2细胞亢进，Th2细胞相关的细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等表达增多，而T-bet和Th1细胞相关的细胞因子IFN-γ、IL-2等表达受限，最终表现为Th1／Th2失衡。研究表明，西药糖皮质激素可通过抑制p38 MAP来间接抑制GATA-3及其下游IL-4等细胞因子的表达，从而控制哮喘症状［7］。而一些动物实验研究表明，中药（如三拗汤、培本中药及麻杏甘石汤等）亦可通过抑制支气管哮喘大鼠肺组织GATA-3 mRNA的表达，降低肺泡中IL-4水平，进而改善气道炎症［8－10］。此外，临床医师在用银杏叶片联合布地奈德吸入治疗中、重度哮喘患儿时发现，银杏叶制剂通过拮抗血小板活化因子的作用，明显降低其IL-4水平和IL-4／IFN-γ的比值，从而提高临床症状控制率［11］。由此可见，通过抑制Th2细胞，纠正Th1／Th2细胞的平衡可有效控制哮喘。

表1 各组PBMC中T-betmRNA和GATA-3 mRNA的比较 ±s

a：P＜0．01，与对照组比较

T-betmRNA／GATA-3 mRNA颗粒组 治疗前 24 3．89±1．17 8．13±2．56a 0．47±0．12组别 n T-betmRNA（×10－3） GATA-3 mRNA（×10－3）a治疗后 4．13±1．20 3．39±1．02 1．21±0．39 t值 1．21 7．14 8．39 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01常规组 治疗前 24 3．91±1．19 7．93±2．37a 0．49±0．14a治疗后 4．20±1．23 3．41±0．91 1．24±0．41 t值 1．09 6．93 7．68 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01对照组20 3．95±1．21 3．32±0．84 1．18±0．37

表2 各组血浆中IFN-γ和IL-4水平的比较 ±s

a：P＜0．01，与对照组比较

／IL-4颗粒组 治疗前 24 9．01±2．32 34．78±7．03a 0．31±0．07组别 n IFN-γ（pg／mL） IL-4（pg／mL） IFN-γ a治疗后 11．25±3．54 8．23±2．87 1．37±0．29 t值 1．13 8．05 9．16 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01常规组 治疗前 24 8．89±2．10 33．21±6．65a 0．29±0．05a治疗后 10．92±3．26 8．01±2．69 1．38±0．28 t值 0．97 7．71 9．59 P值 ＞0．05 ＜0．01 ＜0．01对照组20 9．34±2．99 7．54±2．41 1．31±0．24

中医认为哮喘是因机体肺、脾、肾三脏不足，痰饮留伏，外因诱发，触动伏痰，痰阻气道所致。小儿哮喘因其生理特点，发作易从热化，辨证属热型哮喘者居多，故治疗多从痰热入手。咳喘颗粒剂正是基于这一理论所创，具有宣发肺气、止咳平喘、通畅肺络、清热化痰、活血化瘀等功效，临床应用于儿童轻、中度热型哮喘急性发作期的治疗。本研究显示，咳喘颗粒剂治疗儿童热型哮喘疗效与常规西药一致（P＞0．05）；热型哮喘患儿外周血中Th2细胞相关因子（GATA-3和IL-4）表达明显增强（P＜0．01），而Th1细胞相关因子（T-bet和IFN-γ）的表达并无明显改变（P＞0．05），且外周血中Th1与Th2细胞相关因子的比值（T-bet mRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4）均明显偏低（P＜0．01），均提示热型哮喘患儿体内存在着Th1／Th2细胞失衡和Th2细胞过度活化；过度活化的Th2细胞产生较多的细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等导致气道慢性炎症，与唐丹等［12］研究结果相似。此外，颗粒组患儿外周血中Th2细胞相关因子（GATA-3和IL-4）的表达均较治疗前明显降低，Th1与Th2细胞相关因子的比值（T-betmRNA／GATA-3 mRNA和IFN-γ／IL-4）均较治疗前明显增加，临床症状得到明显改善［2］，肺功能明显提高［3］，而其外周血中Th1细胞相关因子（T-bet和IFN-γ）的表达仅有轻度增加（P＞0．05），说明咳喘颗粒剂主要通过影响体内Th2细胞而使哮喘得到缓解。由于哮喘病理机制复杂，治疗后易复发，故急性发作期轻、中度热型哮喘患儿经咳喘颗粒剂治疗进入缓解期后仍需吸入糖皮质激素，或根据缓解期不同的中医证型服用相应的中药以巩固疗效，防止日后复发。

综上所述，热型哮喘患儿体内存在着Th2细胞亢进，Th1／Th2细胞失衡，咳喘颗粒剂可通过抑制Th2细胞，纠正Th1／Th2细胞失衡。由于咳喘颗粒剂由10多种中药组成，生物活性成分较复杂，故要明确其中各中药确切的作用机制，还需对其拆方作进一步研究。

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Effect of Kecuan granule on Th1／Th2 cells in peripheral blood from children w ith hot asthma

WANG Hai-sheng1，WANGWu-qiang2，LIU Xiao-lin1，XUE Jian-hua1，WU Yu-fang1，MAMei-xiang1
（1．Department of Clinical Laboratory，2．Departmentof Chinese Pediatrics，Wujin Hospital of Traditional Chinese Medicine，Changzhou Jiangsu 213161，China）

Objective：To explore the effect of Kecuan granule on Th1／Th2 cells in peripheral blood from children with hot asthma．M ethods：Forty-eight children with hot asthma were randomly divided into granule group and routine group，24 cases in each group．The granule group

the administration of kecuan granule，three times per day，1 course of 3-d treatment，for 2 courses；and the routine group received the administration of routine western medicine，pulmicort turbuhaler，10μg／inhaling，and terbutaline sulfate aerosol，0．25mg／spray，twice per day，for one week．Additionally，20 healthy children served as controls．ThemRNA levels of T-box expressed in T cells（T-bet）and GATA binding-3（GATA-3）in human peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were detected by quantitative real-time PCR and the levels of interferon-γ（IFN-γ）and IL-4 in plasmawere detected by ELISA．Results：Total effective rates of the granule group and routine group were 95．83%and 91．67%，respectively，showed no significant differences（χ2＝0．559，P＞0．05）．Before treament，the levels of GATA-3 mRNA and IL-4 in the granule group and routine group were notablely higher than those in the control group（P＜0．01），and there were no significant differences in the levels of T-betmRNA and IFN-γamong the three groups（P＞0．05），but the ratios of T-betmRNA／GATA-3mRNA and IFN-γ／IL-4 in the granule group and routine group were sig-nificantly lower than those in the control group（P＜0．01）．After treatment，there were no significant differences in the levels of T-betmRNA，GATA-3 mRNA，IL-4，IFN-γand the ratios of T-betmRNA／GATA-3 mRNA and IFN-γ／IL-4 among the three groups（P＞0．05），but in the granule group and routine group，the levels of GATA-3 mRNA and IL-4 weremarkedly lower than before treatment（P＜0．01），the ratios of T-betmRNA／GATA-3 mRNA and IFN-γ／IL-4 were notably higher（P＜0．01），and the levels of T-betmRNA and IFN-γwere only slightly higher than those before treatment（P＞0．05）．Conclusion：Children with hotasthma showed Th2 accentuation and the imbalance of Th1／Th2，which could be cured by kecuan granule through inhibiting Th2 cells and correcting the imbalance of Th1／Th2．

kecuan granule；hot asthma；children；Th1 cell；Th2 cell

R725．7；R289．54

A

1671－7783（2014）05－0408－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140071

江苏省常州市武进区科技项目（WS201231）

王海生（1971—），男，江苏扬州人，硕士，副主任技师，主要从事免疫调节方面的研究。

2014－03－20 ［编辑］ 刘星星