微生物法快速检测食品中维生素B12含量的应用研究

（广东省广州市质量监督检测研究院）

维生素是维持人体生长发育及新陈代谢而必须从食物中获得的微量有机物质之一。许多食品会添加维生素，但强化维生素应符合适宜人群的摄入量，应能在特定条件下保持质量的稳定。加大对维生素检测方法及技术的研究，对科学控制维生素在食品中的添加量具有重要的意义。

维生素B12(VB12)，又称钴胺素（Cobalamin），是非常重要的水溶性维生素之一，主要用于保健食品、谷物、饮料、乳品和婴儿食品的营养强化。由于食品成分复杂、存在多种干扰因素，而且其VB12的含量十分微量，因此化学分析法的应用受到限制。目前，微生物法仍为国际官方机构测定VB12的的首选认可方法。

虽然微生物法在维生素检测过程中有较高的灵敏度和精确度[1]，但是仍然存在步骤繁琐、操作耗时、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题[2]。本文建立了微生物法测定食品中VB12含量的快速方法，与传统微生物检测法相比具有检测周期短、操作步骤简便、结果准确性与重现性高的优势。

1 材料

1.1 试验菌株

试验菌株为莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmanniii），ATCC 7830，来源为美国典型培养物保藏中心。

1.2 培养基

培养基为：乳酸杆菌肉汤培养基，乳酸杆菌琼脂培养基，VB12测定培养基；均来自BD（碧迪医疗器械（上海）有限公司上海办事处）。

1.3 标准品

标准品为VB12，来自USP（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.4 缓冲液

无水磷酸氢二钠0.65 g（广州化学试剂厂），无水偏重亚硫酸钠0.01 g（上海化学试剂总厂），一水合柠檬酸0.6 g（广州化学试剂厂）；用100 mL蒸馏水溶解制得缓冲液，使用前配制。

1.5 试验样品

试验样品为：SRM 1849a（NIST，National Institute of Standards and Technology）、配方乳粉、配方米粉、含乳饮料、功能饮料。

2 试验方法

2.1 菌种的制备

将乳酸杆菌肉汤培养物离心洗去肉汤培养基，并使用含有甘油的测定培养基进行适宜的稀释，加入96排管中，零下80 ℃冻存。

2.2 标准溶液的制备

VB12标准工作溶液的浓度为1.25 ng/mL，在无菌条件下使用无菌滤器过滤备用。

2.3 操作步骤

2.3.1 样品的处理

（1）配方乳粉、含乳饮料等样品：称2～5 g样品，充分溶解后加入缓冲液水解，在无菌条件下使用无菌滤器过滤，根据样品中的VB12的标称含量进行稀释。

（2）配方米粉等样品：称2～5 g样品，加入淀粉酶溶液酶解，灭活后在无菌条件下使用无菌滤器过滤，根据样品中VB12的标称含量进行稀释。

（3）功能饮料等样品：在无菌条件下使用无菌滤器过滤得到样品溶液，根据样品中维生素B12的标称含量进行稀释。

2.3.2 标准曲线的制备

在无菌条件下，按表1顺序在灭菌小管中对VB12标准品进行稀释，制备相应浓度的标准曲线溶液。

表1 VB12标准曲线溶液的制备

将冻存有试验接种菌悬液的小管恢复到室温，在每管中加入300 μL系列标准曲线溶液和300 μL无菌维生素B12测定培养基，一式3 份。使用涡旋振荡器混合。

2.3.3 样品测定液

在无菌条件下，按表2顺序在灭菌小管中对样品测定液进行稀释，制备相应浓度的样品测定溶液。

将冻存有试验接种菌悬液的小管恢复到室温，在每管中加入300 μL系列样品测定溶液和300 μL无菌VB12测定培养基，一式3 份。使用涡旋振荡器混合。

2.3.4 培养

（36±1.0）℃培养24～28 h。

2.3.5 测定

混合均匀，使用酶标仪进行读数。平行小管相对偏差小于15%的为有效数值。

表2 VB12样品测定液的制备

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

以标准曲线管VB12含量做横坐标，以吸光度做纵坐标，根据四参数方程拟合标准曲线，结果如图1所示。标准曲线相关系数达到0.9989。

3.2 VB12含量的计算

根据每管的吸光值从标准曲线查得对应的VB12含量，除以相对样液体积（v），得到每管样品溶液中VB12含量。由所有有效管中测得的数值计算平均值（Cx）。样品中VB12含量按下列公式计算：

m（g）为样品质量，f为样品稀释倍数。

以SRM 1849a、配方乳粉、配方米粉、含乳饮料、功能饮料为试验样品，每种样品作6 次平行试验，检测结果见表3。所测数据表明该方法测定VB12含量有效，重复性良好。

图1 VB12含量测定标准曲线

3.3 样品加标回收试验

选择已知维生素B12含量的配方乳粉作为加标试验样品，在样品稀释液中加入一定体积的维生素B12标准溶液，加标量分别为25.0，50.0，100.0 ng，进行3 次重复试验，试验结果如表4所示；回收率为94.2%～103.1%，试验灵敏度高。

表3 VB12含量检测结果

表4 加标回收试验结果

4 讨论

4.1 与国标方法GB 5413.14—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》[3]的比较

国家标准方法为传统微生物法，存在步骤繁琐、操作耗时、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题。

在本方法中，试验体系的体积缩小，标准溶液和样品溶液的制备可以使用1.2 mL小管和移液器进行操作，使得操作更加简便、准确，且代替了大量的容量瓶、试管和移液管等，既节省了人工也避免了杂质、活性物质等对试验结果的影响。本文方法将试验菌株预先固定在96排管，利用甘油保护冷冻的菌种[4]，极大地缩短了试验周期，在提高试验效率的同时，使菌株的活力更加稳定，保证了试验的有效性。在维生素检测过程中有较高的灵敏度和精确度。

4.2 与商品化维生素检测试剂盒的比较

商品化维生素检测试剂盒的优点在于操作步骤简便[5]，但是其配套标准溶液的保藏与制备是影响试验结果准确性的关键因素，并且如果样品溶液只做一个稀释度进行检测也会极大地影响结果准确性。同时试剂盒价格十分昂贵，加重了维生素检验的负担。

在本文方法中，标准溶液的制备准确可靠，样品溶液采取多个浓度进行检测，保证了试验结果的准确性和重现性。同时采用小管进行培养，更利于试验溶液的充分混匀并减少了试验污染风险。

4.3 技术要点总结

在微生物法检测微量维生素含量试验中，试验菌种的活力是影响试验结果的关键因素， 标准曲线的绘制是影响试验结果的直接因素。试验过程中须注意避免杂质对试验菌株生长的影响。在制备样品测定液的过程中，须注意稀释液的均匀性，并采用适宜的稀释倍数。微量稀释过程中要保证准确性。

4.4 微生物法测定VB12含量的优点

维生素分析检测工作对于评价食品营养价值、控制强化食品中维生素的加入量具有重要意义。微生物法测定VB12含量的快速方法，操作步骤简便，有利于建立有效的试验流程和质量管理，保证了试验的有效性和结果的准确性，适于在常规实验室建立和应用。

[1]Gregory M E. The microbiological assay of Vitamin B12in the milk of different animal species. British Journal of Nutrition，1954（8）：340-347.

[2]张丽宏，王克新，王淼，等. 微生物法测定乳粉中维生素B12的应用和探讨. 中国乳品工业，2008，36（10）：58-60.

[3]GB 5413.14—2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定.

[4]Grossowicz N，Waxman S，Schreiber C. CryoprotectedLactobacillus casei：an approach to standardization of microbiological assay of Folic acid in Serum. Netherlands Journal of Immunological Methods，1981，46（2）：129-140.

[5]黄晓林，王淼，张丽宏，等. IFP微孔板试剂盒检测配方乳粉中维生素B12方法探讨. 中国乳品工业，2010（7）：48-49.