PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析*

张莎莎崔 琳宰军华* 李 强，3路玲玲

（1 河南中医学院，河南 郑州，450008；2 河南中医学院第一附属医院，河南 郑州4500003 河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，河南 郑州450000）

PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析*

张莎莎1崔 琳2宰军华2* 李 强2，3路玲玲1

（1 河南中医学院，河南 郑州，450008；2 河南中医学院第一附属医院，河南 郑州4500003 河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，河南 郑州450000）

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）启动子荧光素酶表达质粒构建中扩增、转化、酶切及连接的问题。方法利用PCR技术扩增1100 bp长度PAI-1启动子片段，与PUC-19T载体连接，将PUC19T-PAI-1 1100质粒，及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌（DH5a）后扩增，提取并纯化；以BglⅡ，MluⅠ酶切，电泳并回收PAI-1 1100片段和pGL3-Basic酶切大片段，将PAI-1 1100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中，构建含PAI-1 1100片段荧光素酶质粒。结果扩增PAI-1 1100 bp片段成功，目的片段与载体PUC19T，pGL3-Basic载体连接条件较苛刻，需要增加连接时间及效率的摸索。结论 控制扩增时DNA浓度，胶回收，感受态质量，LB平板质量，内切酶，连接时间及质量比等问题都可增加连接成功概率。

PAI-1；启动子；荧光素酶报告基因；载体连接

基因重组技术是我们在分子生物学研究中较常使用到的基本技术，也是分子生物学实验的基础，它在现代中医药的研究中应用越来越广泛。载体构建是将外源性DNA目的片段通过重组技术转化入受体细胞中繁殖及表达，人工构建为需要的目的质粒，为进一步实验做基础[1，2]。当外源性DNA片段插入到相应载体内时，由于操作方法繁琐，所需时间长，人为性因素较大，容易导致实验难以继续。本文根据自身操作，在扩增、酶切及连接问题上进行总结，现报道如下。

1 实验材料

1.1 试剂

报告基因表达载体pGL-3Basic（PromegaE6721）、PUC19T载体（TAKARA公司D）；大肠杆菌DH5α感受态菌株（TAKARA公司D9057A）、人血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技公司）、PCR扩增mix（北京康为公司CW0069）、DNA marker V、500 bp DNA marker（上海莱枫生物科技有限公司）；DNA凝胶回收试剂盒（GX50）、DNA质粒小量提取试剂盒（Axygen公司AP-MN）；限制性内切酶BglⅡ（Fermentas公司ER0561）和MluⅠ（Fermentas公司ER0081）、T4 DNA连接酶（Fermentas公司ER0041）；琼脂糖（美国Invitrogen公司）。

1.2 仪器

PCR仪（美国Applied Biosystems公司），电泳系统（美国Bio-Rad公司），UVIpro型凝胶成像分析系统（英国Silver Uvitec公司），Milli-Q型超纯水仪（美国Milipore公司），Thermo-I368超低温冰箱，高速低温离心机（德国heraus公司），恒温培养箱（DNP-9082型上海精宏实验设备有限公司），微量离心机（Thermo 公司 MICR017）。

2 方 法

2.1 PAI-1 1100片断的扩增

按试剂盒操作提取人全血基因组DNA，根据设计的引物PCR扩增目的基因组DNA，1.1kb上游：5‘CGACGCGTGAGCCTAACTTTCC GACTG3’；下游：5‘GAAGATCTTCTGCCCTCTGCCTGTG3’，反应体系：PCR mix25 μL，上游引物：1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 10 μL，ddH2O 13 μL，总反应体系50 μL。反应条件：95 ℃，预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，35个循环。取5 u PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射灯下观察电泳条带并用凝胶成像分析系统拍照[3]。

2.2 PUC19T-PAI-1 1100连接反应

获取表达载体的信息，根据试剂盒操作进行连接反应。连接体系：PUC19T 1 μL，solutionⅠ5 μL，DNA产物：4 μL，总10 μL，16度连接3 h，见图1、图2。

2.3 PUC19T-PAI-1 1100及PGL-3 Basic质粒的提取

将连接的PUC19T-PAI-1 1100及pGL-3 Basic转入大肠杆菌DH5a中。具体操作步骤如下：取3支100 μL感受态细菌于冰上融化，在其中2支分别小心加入连接产物，另一支阳性对照，轻轻混匀，冰水浴30 min，42 ℃热休克90 s，快速冰浴5 min，使其骤冷。加入800 μL不含Amp的液体LB培养基，37 ℃摇床150 rpm培养1 h。3000 rpm离心3 min，弃上清，余200 μL液体使沉淀重悬，涂布于含Amp的固体LB平板上，待液体完全吸收后，37 ℃恒温培养箱过夜培养。第2天挑取阳性克隆，使用质粒小提试剂盒抽提质粒，进行双酶切，电泳鉴定后，纯化PAI-1 1100片段和pGL-3 basic质粒，获得目的质粒[4]。

2.4 pGL3 Basic-PAI-1 1100的连接

双酶切PAI-1 1100片断及pGL-3 Basic质粒，取5 μL琼脂糖凝胶分析后，进行纯化回收，再次电泳鉴定后，根据试剂盒操作进行连接反应。连接体系：T4DNA Ligase 2 μL，T4 buffer 1 μL，DNA产物：13 μL，pGL-3 Basic 4 μL，总20 μL，16度连接过夜。

2.5 pGL3 Basic-PAI-1 1100的转化：按2.3步骤进行。

2.6 质粒小提试剂盒抽提质粒DNA并酶切鉴定，待第2天观察连接转化的固体LB平板，如果长出单个菌落，挑菌摇菌小提后酶切初步鉴定。

3 结 果

实验证明，扩增时DNA浓度问题，感受态问题，内切酶问题及连接产物质量比等都会导致实验室败。

3.1 扩增条件及结果分析

扩增PAI-1 1100启动子片段，并将之与PUC19T载体连接，提取后酶切纯化，获得目的片段。

3.2 连接产物酶切纯化后电泳

见图3、图4。

图1 pGL-3 Basic质粒载体表达信息

图2 pUC19T连接载体表达信息

图3 连接产物酶切图

图4 模板量过大导致的大量多聚体

3.3 连接后转化

将酶切后的质粒与片段连接后，经反复实验，LB平板上仍长不出菌斑（图5），提示载体未与目的片段连接成功（图6）。

图5 感受态效率低下导致的连接产物空载

图6 连接比例错误导致的空载

4 讨 论

基因重组技术是分子生物学的核心技术，它从基因组DNA的提取，载体的选择，目的片段的扩增，限制酶的切割，载体的连接，大肠杆菌的转化，质粒的提取，每一步都可能产生问题，导致载体与目的片段不能正常连接，现分析如下：

4.1 ①DNA模板量过大会导致PCR产物电泳出现多聚体（图4）在基因重组实验中，基因组DNA的质量是后续所有实验的基础，所以，首先应保证提取高浓度的基因组DNA。人基因组DNA多存在于血白细胞内，因此，应从白细胞中提取高浓度的DNA。②胶回收问题，如果切胶时目的片段切不完全，或者切到杂带，可能导致回收到的不是目的片段。切胶时，要保证回收到目的片段，而且胶不能再紫外线下暴露过长时间，融胶时间不能太短，以免融胶不完全，堵塞柱子，影响回收效率[5]。

4.2 感受态问题，由于使用效率不高的感受态，造成空载（图5）。感受态细胞是处理后容易接受外来DNA进入的细胞，因此，应选择高效率的感受态，才能使连接产物容易转化入感受态内。建议在铺板时同时取20 μL感受态铺于Amp阴性LB平板上，观察感受态生长状况，确保没有因感受态问题影响实验进行。

4.3 LB平板的问题，主要是铺板加入Amp时温度的问题，加入Amp时温度过高，就会导致Amp抗性失活，从而导致克隆菌斑无法筛选出来（图6）。一般选择将消毒好的培养基放入60 ℃水浴锅中，待培养基温度降至60 ℃时加入Amp，以保证Amp的未失活。

4.4 内切酶问题

①因公用buffer体积错误而导致酶切不开（图7）限制酶的选择非常重要，酶切位点选择好后，就要选择效率高的内切酶，了解酶的特征，注意双酶切时公用buffer的体积问题，确定合适的酶切体系。可用两管质粒同时进行，一管双酶切，另一管先单酶切，然后再用另一个酶单切，判断酶切质量，保证酶切效率[6]。②酶切时间问题，酶切时间过长可能引起酶切太过，导致酶切产物丢失（图8），应根据试剂盒选择酶切温度及时间，一般用16 ℃过夜或者37 ℃过夜，其实酶切时间3 h就足够了。酶切完纯化回收后，跑胶确定目的片段和载体回收回来，确保目的片段及载体仍在。

图7 公用buffer错误导致的酶切错误

图8 酶切时间过长导致的产物丢失

4.5 载体与目的片段的质量比问题

如果连接时载体量过大，或者载体去磷酸化，或者连接上其他目的片段的载体，可能导致连接的不是目的片段（图9）。连接时一般载体和目的片段的比例是1∶（3～10），如果连接时效率不高，排除感受态问题后，就要反复试验载体与目的片段的摩尔比，最好电泳一下由亮度判断载体与目的片段大致体积，或者测一下分别的浓度再选择用量。

经长期反复实验总结，DNA的提取及模板量，胶回收，感受态质量，平板质量，到内切酶用量及时间，以及载体的连接整个过程都应时刻注意。但是，由于一定的局限性，我们对载体构建原理及应用，实验结果分析的能力都有很大的不足，因此，我们应严格操作，尽量避免实验中的各种问题才得出正确的结果（图10）。

图9 质量比错误导致的链接错误

图10 排除各种问题后的正确结果

[1] Eckel RH,York DA,Rossner S,et al.Prevention Conference VII: Obesity,a worldwide epidemic related to heart disease and stroke: executive summary[J].Circulation,2004,110(18): 2968-2975.

[2] Giltay EJ,Elber JM.Visceral fat accumμLation is an important determinate of PAI-1 levels in young,nonbese men and woman modμLation bycross-sex hormone administration[J].Thromb Vasc Biol,2004,18(11):1716-1722.

[3] 方肇勤.分子生物学在中医药研究中的应用[M].上海:科学技术出版社,2008.

[4] 彭韦霞.Caveolin1基因沉默对胰岛素刺激的内皮细胞表达PAI1的影响[D].衡阳:南华大学,2007.

[5] 尹晓玲.IL-12真核表达质粒构建及其瘤苗抗肺癌免疫作用研究[D].重庆:重庆医科大学,2009.

[6] 张琴.EBV-LMP2A基因慢病毒载体质粒的构建及体外表达、鉴定[D].温州:温州医学院,2010.

R346

B

1671-8194（2014）11-0062-02

河南省教育厅自然科学研究资助计划项目（2010B360009）；郑州市科技公关计划项目（0910SGYS33391-1）

*通讯作者：E-mail： zaijunh@163.com