Wnt信号通路的β-catenin和拮抗因子SFRP1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

2014-04-13章辉曹学全戴岳楚卢洪胜

浙江医学 2014年17期

章辉曹学全戴岳楚卢洪胜

章辉曹学全戴岳楚卢洪胜

目的探讨Wnt信号通路的β-catenin和拮抗因子SFRP1在甲状腺乳头状癌（PTC）中的表达及意义。方法采用免疫组化PV-8000法检测78例PTC组织和24例正常甲状腺组织中β-catenin和Wnt拮抗因子SFRP1蛋白的表达情况。结果PTC组织中β-catenin阳性表达率明显高于正常甲状腺组织（P＜0.01），而Wnt拮抗因子SFRP1蛋白在PTC组织中阳性表达率明显低于正常甲状腺组织（P＜0.01）。β-catenin和Wnt拮抗因子SFRP1蛋白表达均与PTC临床分期、淋巴结转移及患者年龄有关（P＜0.05或0.01），而均与患者性别、肿瘤大小无关（均P＞0.05）。Spearman相关分析显示在PTC组织中两者之间表达呈负相关（P＜0.01）。结论β-catenin和SFRP1蛋白表达异常可能与PTC的发生、发展有关。两种蛋白联合检测对判断PTC的恶性程度和病情进展有重要价值。

甲状腺乳头状癌 Wnt/β-catenin SFRP1

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤之一，甲状腺癌在全球发病率每年增长约4%[1-2]。我国沿海省份是甲状腺癌的高发地区，女性发病率明显高于男性，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）占80%。PTC属于高分化肿瘤、侵袭性较弱、预后较好。但在临床工作中我们也发现，有一些PTC甚至是微小PTC的患者在初诊时就出现大量的淋巴结转移，表现出较高的侵袭性。因此，进一步研究PTC的发病机制及早期诊断十分必要。

近年在肿瘤干细胞的研究上，经典Wnt/β-catenin通路对癌干细胞的影响成为热点[3-4]。研究显示，βcatenin是一种多功能的浆蛋白质，在细胞连接处与E-cadherin相互作用，参与形成粘合带；而游离的βcatenin进入胞核，调节基因表达。Wnt信号通路重要的拮抗因子SFRP1，可与受体竞争结合Wnt蛋白，或直接与Wnt蛋白结合，从而阻断了Wnt信号转导通路。故我们研究了 Wnt信号通路的 β-catenin和拮抗因子SFRP1在PTC中的表达及意义，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料选取本院2012-02—2013-12经手术切除并且具有完整病史的PTC石蜡包埋组织78例，男23例，女55例，年龄18～80岁，中位年龄49岁；所有患者术前均未进行放、化疗及内分泌治疗。TNM（UICC）分期：Ⅰ期患者44例、Ⅱ期19例、Ⅲ～Ⅳ期15例；无淋巴结转移40例，有淋巴结转移38例。另取同期癌旁3～5cm处的正常甲状腺组织24例作对照。所有切片经病理科多位诊断医师阅片证实。所做标本均经10%中性缓冲甲醛溶液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片。

1.2 实验试剂 β-catenin鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物有限公司，兔抗人SFRP1多克隆抗体购自美国santa cruz公司（工作浓度1∶100稀释），PV-8000染色试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 方法常规4μm连续切片，切片经60～70℃烤箱30min烤片后，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水。本实验采用EDTA液中热修复方法10～20min，室温下自然冷却，蒸馏水洗，滴加3%H2O2溶液10min以灭活内源性过氧化物酶的活性。PBS液冲洗3×3min，滴加一抗后置4℃冰箱过夜；PBS液冲洗3×3min，滴加二抗，室温下15～20min；PBS液冲洗3×3min，DAB显色剂显色，蒸馏水冲洗、苏木素衬染、1%盐酸返蓝；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。用PBS液代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。

1.4 结果判断 β-catenin以细胞膜或细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，SFRP1蛋白以细胞质内出现棕黄色颗粒染色为阳性细胞（核中亦有少量表达）。400倍视野下选择5个以上高倍镜视野，连续计数1 000个癌细胞，阳性细胞数＜10%为阴性，≥10%为阳性。

1.5 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，变量间的关系采用spearman相关分析。

2 结果

2.1 β-catenin和SFRP1在PTC和正常甲状腺组织中的表达 β-catenin阳性表达（图1）；SFRP1阳性表达（图2）。β-catenin、SFRP1的阳性表达率在正常甲状腺组织中分别为8.33%（2/24）和75.00%（18/24），PTC组织中分别为67.95%（53/78）和29.49%（23/78），两组比较差异均有统计学意义（χ2=27.787、15.815，均P＜0.01）。

2.2 β-catenin、SFRP1阳性与PTC临床病理特征的关系见表1。

由表1可见，β-catenin和SFRP1阳性分别与PTC临床分期、淋巴结转移及患者年龄有关（P＜0.05或0.01），而与患者性别、肿瘤大小均无关（均P＞0.05）。2.3 β-catenin、SFRP1在PTC组织中表达的关系见表2。

图1 β-catenin在PTC组织中表达（免疫组化PV-8000法，×200）

图2 SFRP1在PTC组织中表达（免疫组化PV-8000法，×200）

表1 β-catenin、SFRP1阳性与PTC临床病理特征的关系[例（%）]

表2 β-catenin、SFRP1在PTC组织中表达的关系（例）

由表2可见，β-catenin和SFRP1蛋白在PTC组织中的表达呈负相关。

3 讨论

细胞信号转导通路广泛存在于多细胞真核生物中，是一条高度保守的信号通路。其中经典Wnt通路[3]：通过β连环蛋白（β-catenin）的核异位，激活靶基因的转录活性。众多学者研究发现[5-7]，β-catenin稳定性的调节是Wnt/β-catenin信号转导通路的核心机制。Wnt蛋白因子通过膜受体卷曲蛋白（Frizzled，FZD）和LRPS/LRP6辅助受体结合，促动细胞内的信号转导，使β-catenin在胞质内累积，然后进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与T细胞转录因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）共同结合复合体TCF/LEF-β-catenin-Legless-YGO，充当着许多基因的转录调节器，从而激活下游靶基因c-myc、Cyclin D1的转录，促进肿瘤细胞分化增殖[8]。β链接素（β-catenin）既是Wnt信号传导通路的关键调整控点，又是上皮钙黏附素复合体的重要组分，与肿瘤的发生、浸润和转移密切相关。本研究对78例PTC病例进行检测，结果显示β-catenin在PTC组织67.95%（53/78）的表达，高于正常甲状腺组织8.33%（2/24），差异有统计学意义（P＜0.05）。提示β-catenin是一种促癌细胞增殖生长的基因蛋白。通过β-catenin与PTC临床病理特征分析结果显示，β-catenin表达与PTC临床分期、淋巴结转移及患者年龄有相关性，而与患者性别、肿瘤大小无关。推测β-catenin可能与PTC的发生、转移及发病年龄有关。

Wnt拮抗因子SFRP1是分泌型糖蛋白家族之一，定位于染色体8p12-11.1。SFRP1蛋白可以竞争性抑制Fz受体而抑制Wnt信号通路的活动，是Wnt信号通路的负性调节剂。它通过干扰配体-受体间的相互作用而阻断Wnt信号通路，从而调控肿瘤细胞的生长，增殖[9-11]。本实验检测发现，SFRP1蛋白在PTC组织中表达的阳性率29.49%（23/78），明显低于正常甲状腺组织的75.00%（18/24），差异有统计学意义（P＜0.05）。结果与众多学者研究发现[10-12]，SFRP1基因调节失控导致各种肿瘤细胞生长增殖的观点相一致。通过SFRP1蛋白与PTC临床病理特征分析结果显示，SFRP1蛋白表达与PTC临床分期、淋巴结转移和患者的发病年龄有相关性，而与患者性别、肿瘤大小无关。提示SFRP1蛋白可能与PTC的转移、预后及患者年龄呈负相关性。

综上所述，在PTC组织中β-catenin的高表达和SFRP1蛋白的低表达，两者呈负相关性。提示β-catenin和SFRP1蛋白可通过对经典Wnt/β-catenin信号通路的正负调控，传导或阻断Wnt信号通路，从而调控肿瘤细胞的增殖和淋巴结转移。联合检测β-catenin和 SFRP1蛋白有望成为判断甲状腺乳头状癌预后的一个重要指标，也有可能为甲状腺乳头状癌的早期诊断和临床治疗开辟一条新途径。

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Expression of β-catenin and antagonist factor SFRP1 in papillary thyroid carcinoma and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of β-catenin of Wnt signaling pathway and its antagonist factor SFRP1 in papillary thyroid carcinoma(PTC)and its clinicopathological significance.MethodsThe expression of β-catenin and SFRP1 was detected by immunohistochemical PV-8000 method in 78 cases of papillary thyroid carcinoma and 24 samples of normal thyroid tissue.Resultsβ-catenin expression in PTC was significantly higher and SFRP1 expression was lower than that in normal thyroid tissue(both P＜0.01).The expression of β-catenin and SFRP1 in PTC was correlated with clinical stage and lymph node metastasis and age of the patients(P＜0.05 or P＜0.01)，while not correlated with sex and tumor size.Spearman correlation analysis showed that there was a negative correlation between β-catenin and SFRP1 expression in PTC(P＜0.01).ConclusionThe abnormal expression of β-catenin and SFRP1 may be involved in the pathogenesis of PTC.The combined detection of two proteins would help to assess the malignant degree and progression of PTC.

Papillary thyroid Carcinoma β-catenin SFRP1