宁波市第二医院住院患者产ESBLs大肠埃希菌耐药性及基因型研究

陈梦婷 张顺 蔡挺

●论 著

宁波市第二医院住院患者产ESBLs大肠埃希菌耐药性及基因型研究

陈梦婷 张顺 蔡挺

目的 了解宁波市第二医院住院患者病原菌培养中产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌的耐药情况及ESBLs基因分布情况。方法 收集2013-12—2014-05病原菌培养中分离的产ESBLs大肠埃希菌并分析耐药结果，以PCR法扩增ESBLs耐药基因并测序分析。结果 75株产ESBLs大肠埃希菌对氨苄西林完全耐药，对第三代头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类药物耐药率较高，多重耐药问题严重。PCR扩增阳性基因包括TEM、CTX-M-9组、CTX-M-1组、OXA-1组、SHV、OXA-10组，检出率分别为85．33%（64株）、81．33%（61株）、49．33%（37株）、10．67%（8株）、5．33%（4株）、4．00%（3株）。64株TEM基因均为TEM-1亚型。CTX-M基因中CTX-M-14、CTX-M-55检出率最高，分别为61．33%（46株）、29．33%（22株），还检出较少基因亚型CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-24、CTX-M-27、CTX-M-65、CTX-M-69、CTX-M-79。8株OXA-1组基因均为OXA-1亚型，4株SHV基因均为SHV-12亚型，3株OXA-10基因均为OXA-10亚型。结论 宁波市第二医院病原菌培养中分离的产ESBLs大肠埃希菌耐药情况较严重；ESBLs基因型以CTX-M-14最常见。

大肠埃希菌 超广谱β-内酰胺酶 耐药性 基因型

1 材料和方法

1.1 菌株来源 75株大肠埃希菌（不包括来自同一患者的重复分离菌株）分离自宁波市第二医院2013-12—2014-05临床各科室送检的住院患者标本，标本包括痰液、尿液、血液、分泌物等。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、ATCC35218均购自卫生部临床检验中心。

1.2 细菌鉴定、药敏试验及ESBLs表型检测 使用法国生物梅里埃公司VitekⅡ全自动细菌鉴定仪及配套的革兰阴性菌鉴定卡对菌株进行鉴定，以配套的药敏卡行药敏试验及ESBLs检测。为便于统计，“中介”结果纳入“耐药”处理。

1.3 细菌质粒DNA提取 使用Omega质粒小提试剂盒（美国Omega公司产品）进行质粒提取。

1.4 PCR扩增 根据GenBank上ESBLs基因的保守序列，使用Oligo7.0软件设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列及扩增片段长度见表1。25μl PCR反应体系：模板 DNA 10～100ng，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，上下游引物10μmol/L各1μl，Taq DNA聚合酶1U，ddH2O 17.3μl。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，不同引物按表1所示温度退火30s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物行1.00%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统上成像。

1.5 基因测序 PCR产物送深圳华大基因技术服务有限公司进行DNA测序，测序结果用NCBI上的BLAST Search进行比对分析。

2 结果

2.1 药敏试验结果 产ESBLs的大肠埃希菌对氨苄西林100.00%耐药，对第三代头孢菌素如头孢曲松、头孢他啶耐药率分别为97.33%和56.00%，对新的第四代头孢菌素如头孢吡肟也有34.67%的耐药率。对于常用喹诺酮类药物如环丙沙星、左氧氟沙星耐药率较高，分别为81.33%和80.00%，常用氨基糖苷类药物如庆大霉素、妥布霉素分别有54.67%和58.67%的耐药率。所检菌株中只有1株对碳青霉烯类药物厄他培南耐药，耐药率1.33%。75株产ESBLs大肠埃希菌对20种常用抗生素耐药情况见表2。

2.2 基因型分析 对75株产ESBLs的大肠埃希菌进行耐药基因PCR扩增，部分结果见图1。共有74株检出ESBLs基因，检出率98.67%。其中TEM、CTX-M-9组基因检出率最高，分别为64株（85.33%）和61株（81.33%）。另外CTX-M-1组检出37株（49.33%），OXA-1组检出8株（10.67%），SHV检出4株（5.33%），OXA-10组检出3株（4.00%），其余基因未检出。

表1 引物序列及扩增片段长度

表2 75株产ESBLs大肠埃希菌的耐药性

图1 部分基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图（M：DNA Marker；1～3：检测菌株；P：阳性对照；N：阴性对照）

耐药基因测序后经BLAST Search比对，所有64例TEM基因均为TEM-1亚型。37例CTX-M-1组基因中CTX-M-55为主要基因亚型，共检出22株，检出率29.33%；CTX-M-15亚型检出7株（9.33%）；检出少量CTX-M-3、CTX-M-69、CTX-M-79基因亚型。61例CTX-M-9组基因中CTX-M-14亚型检出率最高，检出46株（61.33%）；CTX-M-65亚型检出9株（12.00%）；检出少量 CTX-M-27、CTX-M-24基因亚型。8株（10.67%）OXA-1组基因均为OXA-1基因亚型，4株（5.33%）SHV基因均为SHV-12亚型，3株（4.00%）OXA-10组基因均为OXA-10基因亚型，见表3。

3 讨论

大肠埃希菌是临床分离最常见的菌株之一，2012年中国细菌耐药监测网（CHINET）资料显示，大肠埃希菌在所有临床菌株分离中居首位，占27.00%以上[2-3]。近年来，由于抗生素的不断使用，尤其是第三代头孢菌素的不合理使用，大肠埃希菌耐药机制在抗生素选择性压力下不断发展，其中最重要的就是产生ESBLs。该酶主要定位于质粒，可以在同种及不同种菌株间传播；且这一耐药质粒常携带对喹诺酮类、氨基糖苷类等抗生素耐药的基因，表现为多重耐药，给临床治疗带来众多问题，导致患者病死率增高、住院时间延长、治疗费用上升、治疗选择性越来越狭窄等。

表3 74株产ESBLs大肠埃希菌耐药基因扩增及测序结果

本研究中，产ESBLs大肠埃希菌对氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林耐药严重，均在95.00%以上，对第三代头孢菌素如头孢曲松、头孢他啶等也有较高耐药率，对新的第四代头孢菌素如头孢吡肟也有将近40.00%的耐药率。产ESBLs大肠埃希菌对常用的喹诺酮类药物如环丙沙星、左氧氟沙星耐药率较高，约80.00%，对常用的氨基糖苷类药物如庆大霉素、妥布霉素有60.00%左右的耐药率，多药耐药现象非常严重，且这一数据远远超过CHINET全国监测数据[2]。对于酶抑制剂复合抗生素，产ESBLs大肠埃希菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率远高于哌拉西林/他唑巴坦，分别为36.00%和8.00%，可能与前者在该院临床应用较广有关。头孢西丁作为头霉素类药物，产ESBLs大肠埃希菌对其耐药率已达46.67%。碳青霉烯类药物耐药多见于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等[4-5]，产ESBLs大肠埃希菌对其仍较敏感[6]，所检菌株中只有1株对厄他培南耐药，对亚胺培南敏感率100.00%，说明碳青霉烯类药物仍可作为治疗产ESBLs大肠埃希菌最有效的药物，但要注意监测耐药菌株的出现。

PCR结果显示，所有菌株中有1株产ESBLs大肠埃希菌未检测到上述耐药基因，可能为其他少见基因型[7]。从PCR结果可以看到本研究中大肠埃希菌ESBLs基因型以TEM和CTX-M为主，但目前为止我国流行的ESBLs主要是以水解头孢噻肟为主的CTX-M型ESBLs，所检测出的TEM型基因也多为广谱β-内酰胺酶TEM-1型，ESBLs型的报道很少[8-10]。为明确该院流行的TEM基因型到底是广谱还是超广谱酶，将所有TEM扩增阳性基因测序比对后，发现均为TEM-1基因亚型，TEM-1基因为广谱β-内酰胺酶，而非ESBLs类。

根据氨基酸序列的同源性，可将CTX-M型ESBLs分为5个组。本研究中产ESBLs大肠埃希菌主要检出CTX-M-9组和CTX-M-1组，CTX-M-9组中CTX-M-14亚型检出最多，CTX-M-1组中以CTX-M-55亚型为主。近年来，能够水解头孢他啶的CTX-M-15已成为全球最常见的ESBLs亚型，甚至在部分国家地区暴发流行[11]。本研究共检出7株产CTX-M-15亚型ESBLs的大肠埃希菌，检出率9.33%，应引起足够重视。本研究中4株SHV基因均为SHV-12亚型，是亚洲地区主要流行亚型之一[12]。传统产OXA基因菌株主要为铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等，本次检测的产ESBLs大肠埃希菌中检测出8株OXA-1亚型和3株OXA-10亚型基因，可能由于OXA基因多位于质粒上，具有很强的扩散能力，容易通过转化、结合等方式转移至大肠埃希菌。

大肠埃希菌的耐药问题越来越严重，产ESBLs菌株多为多重耐药，临床治疗越发困难。加强对产ESBLs大肠埃希菌的耐药监测和基因监测，对临床合理应用抗生素、预防和控制ESBLs在医院内的传播流行具有重要意义。

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Drug resistance and genotype of ESBLs-producingisolated from patients in Ningbo Second Hospital

Objective To investigate the drug resistance and genotypes of extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)-producingisolated from patients in Ningbo Second Hospital．Methods Clinical strains ofwere isolated from inpatients of Ningbo Second Hospital during December 2013 and May 2014．Drug resistance was detected and genotype of ESBLs was determined by PCR method．Results All 75 clinical isolates ofwere resistant to ampicillin,and showed high resistance rate of third-generation cephalosporins,fluoroquinolones and aminoglycosides．The positive rates of ESBLs-producing genotypes TEM,CTX-M-9 group,CTX-M-1 group,OXA-1 group,SHV,OXA-10 group were 85．33%(64),81．33%(61),49．33%(37),10．67%(8),5．33%(4)and 4．00%(3),respectively．The genotype of 64 isolates with TEM gene was TEM-1．The main genotypes of CTX-M group were CTX-M-14 and CTX-M-55,which account for 61．33%(46)and 29．33%(22),respectively;while CTX-M-3,CTX-M-15,CTX-M-24,CTX-M-27,CTX-M-65,CTX-M-69 and CTX-M-79 genotypes accounted for fewer percentage of CTX-M genotype．The genotype of 8 isolates with OXA-1 gene was OXA-1,those of 4 isolates with SHV gene and 3 isolates with OXA-10 gene were SHV-12 and OXA-10,respectively．Conclusion The drug resistant rate of ESBLs-producingin this hospital is high,and the most prevalent genotype of ESBLs is CTX-M．

Extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)Drug resistance Genotype型分析，对指导临床合理应用抗生素，预防和控制感染有重要意义。

2014-08-11）

（本文编辑：胥昀）

宁波市科技创新团队（2011B82016）；宁波市社发重大专项基金（2010C50038）

315000 宁波大学医学院（陈梦婷系在读研究生，现在宁波市第二医院实习）；宁波市第二医院干细胞实验室（张顺、蔡挺）

蔡挺，E-mail:caiting@nbu.edu.cn

超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lacta- mases，ESBLs）可以水解青霉素、广谱及超广谱头孢菌素和单环β-内酰胺抗生素，是临床上大肠埃希菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要机制。近年来对耐药大肠埃希菌感染的预防与治疗已逐渐成为临床医师需要面对的重要问题[1]，而不同地区使用抗生素的种类和频率不同将导致不同基因型的ESBLs产生，后者则可以表现出相同或者不同的耐药表型，从而影响临床治疗的效果。因此对产ESBLs大肠埃希菌进行耐药谱和基因