microRNA-195在食管鳞状上皮细胞癌中的表达及临床意义

2014-04-13王江峰凌志强毛伟敏

浙江医学 2014年4期

王江峰凌志强毛伟敏

王江峰凌志强毛伟敏

目的检测microRNA-195（miR-195）在食管鳞状上皮细胞癌组织中的表达水平，探讨其临床病理生理学意义。方法应用实时荧光聚合酶链反应法检测94例食管鳞状上皮细胞癌组织和配对癌旁正常组织中miR-195的表达水平，并分析miR-195表达水平与食管鳞状上皮细胞癌患者临床病理学特征及预后之间的关系。结果食管鳞状上皮细胞癌组织中miR-195不同程度低表达45例（47.9%），正常表达39例（41.5%），高表达10例（10.6%）。miR-195低表达者比例在有无淋巴结转移、不同TNM分期者中的差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-195表达水平与患者无瘤生存期显著相关，是食管鳞状上皮细胞癌患者预后的独立危险因素。结论miR-195下调影响食管鳞状上皮细胞癌进展和患者预后，可能起着抑癌基因功能。

microRNA-195 食管鳞状上皮细胞癌无瘤生存期抑癌基因

近年来世界范围内食管癌的发病率和病死率已居恶性肿瘤第6位[1]。食管癌的病理类型主要为鳞状细胞癌和腺癌，鳞状细胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分为腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鳞状上皮细胞癌（简称食管鳞癌）确诊时往往已为晚期，尽管治疗方案的选择迅速发展，但侵袭和转移患者的预后不佳。微小RNA（microRNAs）是一类长19～22nt的单链非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3′非编码区不完全互补结合，在转录后水平上影响靶基因mRNAs降解或翻译[3-4]。一个miRNA可通过调控多个靶基因mRNAs发挥着癌基因或抑癌基因的功能[5-6]。有研究表明，microRNA-195（miR-195）在肝癌和结肠、直肠癌组织中的表达水平明显降低，且与肿瘤的增殖、周期、淋巴转移和预后等相关[7-8]。也有研究表明，miR-195在食管鳞癌中的表达与细胞增殖、浸润和转移相关[9]。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应法（realtime PCR）检测食管鳞癌组织中miR-195的表达水平，分析其与患者临床病理特征和预后之间的关系，旨在探讨miR-195的表达在食管癌进展、预后中的意义,为预测食管癌转移潜能和评估预后寻找新的生物学指标，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象收集2008-02—2009-11浙江省肿瘤医院食管癌手术切除组织标本94例，均为食管鳞癌及其配对癌旁正常组织，患者男82例，女12例，年龄46～80岁，平均（63.26±7.88）岁。术前未经任何放化疗及其它治疗，排除自身免疫性疾病或严重感染性疾病；癌旁正常组织取自肿瘤边缘5cm外区域肉眼下正常食管组织，食管癌根治术中标本切取后均立即放入液氮，并立即转移至-80℃冰箱保存。食管癌TNM分期、肿瘤分级均参照国际抗癌联盟（UICC）的标准。记录患者是否吸烟（指一生中连续或累计吸烟6个月以上，并且平均每天至少吸1支）和饮酒（指平均每周1次以上饮用任何酒）[10]。本研究经医院伦理委员会同意，患者均进行电话随访，随访截止时间为2012-07-04。

1.2 试剂 RNA提取试剂盒MirNeasy Mini Kit购自德国Qiagen公司，反转录试剂盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）和real-time PCR试剂盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR081A）购于日本TaKaRa公司。引物由上海捷瑞公司合成。Real time RT-PCR上游引物序列：miR-195：5′-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，内参基因U6：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游通用引物由反转录试剂盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）提供。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取按照MirNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取肿瘤组织及对应正常组织的总RNA，紫外分光光度计测量，检测提取总RNA的浓度和纯度，测定吸光度值（A），要求A260/A280=1.8～2.1。凝胶电泳测定RNA的完整性。

1.3.2 逆转录采用梯度PCR仪（Bio-Rad S1000），按PrimeScrip miRNA cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书将上述提取总RNA（1μg）进行cDNA的合成。逆转录体系（20μl）：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10μl，0.1%BSA 2μl，miRNA PrimeScriptRRT Enzyme Mix 2μl，Total RNA 1μl，RNase Free dH2O 5μl。反应过程：37℃60min，85℃5s，4℃30min。

1.3.3 PCR扩增 RT-PCR的PCR扩增及溶解曲线分析均使用 ABI 7500PCR仪（Applied Biosystems）。PCR试剂采用日本Takara公司Premix Ex TaqTMⅡ，具体操作参照SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ说明书。结果按 2-ΔΔCT法分析：ΔCT=Ct（miR-195）-Ct（U6）；按ΔΔCT=ΔCT（癌组织）-ΔCT（癌旁正常组织）计算miR-195在癌组织和癌旁正常组织中表达情况，当ΔΔCT＞1，表示表达下降；-1＜ΔΔCT＜1，表示表达正常；ΔΔCT＜-1，表示表达升高，最终采用2-ΔΔCT计算相对改变倍数。

1.4 统计学处理应用SPSS18.0统计软件。计量资料以表示，采用配对样本t检验；计数资料采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，影响患者预后的多因素分析采用Cox回归。

2 结果

2.1 miR-195在食管鳞癌和癌旁正常组织中的表达水平 94例食管鳞癌标本中miR-195相对癌旁正常组织为低表达45例（47.9%），正常表达39例（41.5%），高表达10例（10.6%）。采用2-ΔΔCT计算miR-195相对癌旁正常组织的表达倍数，各样本相对表达倍数取对数（lg2-ΔΔCT）统计作图，详见图1。

图1 患者食管癌组织中相对正常组织的表达量

2.2 miR-195低表达者比例与临床病理特征的关系miR-195低表达者比例在淋巴结有无转移和不同肿瘤TNM分期者中的差异均有统计学意义（均P＜0.05），有淋巴结转移者miR-195低表达者比例高于无淋巴结转移者；Ⅰ/Ⅱ期患者miR-195低表达者比例低于Ⅲ/Ⅳ期患者。而不同年龄、性别、分化程度、肿瘤位置、浸润程度及有无肿瘤家族史、吸烟史、饮酒史者间miR-195低表达者比例的差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表1。

2.3 miR-195表达水平与预后的关系

2.3.1 miR-195表达水平与生存时间的关系 94例食管鳞癌患者按miR-195相对表达水平分为低表达组（45例）和非低表达组（49例），采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并比较两组的无瘤生存期和危险函数，结果显示非低表达组患者较低表达组患者有生存优势，且低表达组患食管鳞癌的危险度较非低表达组高（P＜0.05），详见图2。

2.3.2 临床病理特征、生活习惯与生存时间的关系Cox回归分析结果显示，miR-195的表达水平作为食管鳞癌患者预后的影响因素，风险系数为9.503（P＜0.05），表明miR-195的表达水平是影响患者生存的独立危险因素，详见表2。

表1 食管鳞癌组织miR-195低表达与临床病理特征的关系

表2 影响94例食管鳞癌患者无瘤生存的多因数分析

3 讨论

食管鳞癌的发生和发展是一个多因素、多步骤的过程，也是多基因发生异常表达的过程。随着研究的进展，许多小分子生物学标志物表达的变化与食管鳞癌的发生、发展和预后密切相关，且在临床上广泛的应用[11]。microRNAs是一类大小约20nt，具有调控功能的内源性非编码小分子RNA[12]。Matsushima等[13]研究发现：miR-21、miR-129、miR-373、miR-103和miR-107在食管癌细胞和组织中的表达较正常高，它们参与了食管鳞癌的增殖、转移、侵袭、凋亡及进展，同时降低了食管鳞癌患者的生存率，表现为癌基因的功能；而miR-153、miR-100、miR-125b、miR-10a、miR-99a、miR-376a、miR-379、miR-651和miR-146b则表达下降，表现为抑癌基因的功能。因此，microRNAs与肿瘤调控的关系成为了研究的热点。

图2 94例食管癌患者中miR-195表达水平与患者生存和疾病危险度的关系

microRNA-195是一个位于17p13.1染色体的小分子RNA，属于miR-15/miR-16家族，其在多种恶性肿瘤中表达下调。Wang等[7]和Xu等[8]研究均发现，miR-195在肝癌组织中的表达较正常组织的表达显著下调。Wang等证实miR-195通过抑制VEGF、VAV2和CDC42基因的表达从而抑制肝癌细胞的血管生成和转移。Xu等也发现miR-195使肝癌细胞阻止于G1/S期，抑制肝癌细胞的增殖和进展。Soon等[14]应用基因芯片技术研究22例肾上腺皮质癌中micorRNAs表达情况发现，miR-195在肾上腺皮质癌中的表达较肾上腺皮质瘤显著下调。同时，miR-195的低表达降低了肾上腺皮质癌患者的生存期。Wang等[7]研究同样发现，miR-195在85例结肠直肠癌中的表达明显下调，且miR-195的低表达和结肠直肠癌患者的淋巴结转移和临床分期成负相关。同时发现miR-195最初是通过调控细胞周期发挥癌基因的功能，miR-195在体外能促进结直肠癌细胞的克隆形成和肿瘤的进展。Liu等[15]也同样报道，miR-195通过直接调控靶基因cyclin D1和CDK6使肺癌细胞株的细胞周期阻滞于G1期，其细胞机制可能是通过Rb-E2F信号通路发挥癌基因的功能，调控多个靶基因（CCND6、CDK6、E2F3等）阻滞细胞周期从G1期向S期的转变。因此，miR-195可能是一个细胞周期相关的microRNA，其表达下调使一系列调控周期的靶基因发挥功能，阻滞细胞周期，减少肿瘤的进展，发挥抑癌基因的功能。本研究结果与上述基本一致，在94例食管鳞癌组织标本中，miR-195相对癌旁正常组织低表达为45例，正常表达39例，高表达10例。miR-195相对癌旁正常组织低表达的患者淋巴结转移较非低表达患者早；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的食管鳞癌组织中miR-195表达水平显著低于Ⅰ/Ⅱ期食管鳞癌组织；miR-195相对癌旁正常组织低表达的患者预后较差。本研究表明miR-195相对低表达能加速肿瘤的进展，减少患者的生存时间。多因素分析也表明miR-195的表达水平是影响食管鳞癌患者生存的独立因素。

本研究结果提示miR-195可能是一种预测食管鳞癌进展和预后指标的小分子RNA，其低表达可能促进食管鳞癌的浸润和进展，同时使患者的预后恶化。本研究只是初步证实了miR-195的表达与食管鳞癌的临床病理特征及预后之间的相关性，miR-195在食管鳞癌中可能发挥着抑癌基因的功能，其具体的分子生物学机制仍需要进一步的研究证实。

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（本文编辑：严玮雯）

《浙江医学》对医学论文中有关实验动物描述的要求

在医学论文的描述中，凡涉及实验动物者，在描述中应符合以下要求：（1）品种、品系描述清楚，（2）强调来源，（3）遗传背景，（4）微生物学质量，（5）明确等级，（6）明确饲养环境和实验环境，（7）明确性别，（8）有无质量合格证，（9）有对饲养的描述（如饲料型、营养水平、照明方式、温度、温度要求），（10）所有动物数量准确，（11）详细描述动物的健康状况，（12）对动物实验的处理方式有单独清楚的交代，（13）全部有对照，部分可采用双因素方差分析。

本刊编辑部

Expression of microRNA-195 in esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance

Objective To investigate the expression of miR-195 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its clinicopathological significance.MethodsThe expression of miR-195 in 94 ESCC samples and matched normal tissue samples was detected by real-time PCR.Results47.9%(45/94)of carcinoma samples showed low expression of miR-195,41.5% (39/94)was negatively expressed and 10.6%(10/94)showed high expression．The low expression of miR-195 was significantly correlated with lymph node metastasis,TNM staging and disease free survival.miR-195 expression level was an independent prognostic factor in patient with ESCC.ConclusionThe down-regulation of miR-195 is associated with the progression of ESCC and prognosis of the patients．

microRNA-195 ESCC DFS Tumor-suppressor