KLF8蛋白膀胱癌组织中的表达及与预后的关系

2014-04-13范晓松汪朔顾利锋

浙江医学 2014年4期

范晓松汪朔顾利锋

范晓松汪朔顾利锋

目的探讨KLF8蛋白在膀胱癌中的表达，并分析其与临床病理特征及预后的关系。方法选择膀胱癌标本137例，正常膀胱组织标本19例，采用免疫组织化学方法，检测膀胱癌和正常组织中KLF8蛋白的表达，并结合临床资料进行分析。结果正常组织中KLF8蛋白的表达水平明显低于肿瘤组织（P＜0.001）。低级别和高级别膀胱癌中KLF8蛋白表达的阳性率分别为37.2%、58.5%，差异有统计学意义（P＜0.05）。非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌中KLF8蛋白表达的阳性率44%和67.4%，差异有统计学意义（P＜0.05）。本组随访7～112个月，在肌层浸润性膀胱癌中，Kaplan-Meier生存显示：KLF8蛋白的阳性表达与膀胱癌患者的总生存率有关（P＜0.05）。结论KLF8蛋白的表达在膀胱癌组织中明显高于正常组织，KLF8蛋白的表达与膀胱癌的分级、分期、预后有关；与患者的年龄、性别、肿瘤的数目无相关性（P＞0.05）。KLF8蛋白的检测有助于膀胱癌的诊断及预后的评估。

膀胱癌 KLF8 免疫组化预后

Krüppel编码一个包含一个DNA结合基序的蛋白质，该基序由几个Cys2/His2型的锌指构成；在哺乳动物中，一群与Krüppel的锌指结构高度同源的蛋白质被发现，并命名为Krüppel样因子（Krüppel-like factor，KLFs），它们是转录调节蛋白，参与广泛的细胞进程[1-3]。KLF8最初是作为Krüppel样C2H2锌指转录因子蛋白质家族的一个转录抑制蛋白而被识别的，通过与辅抑制蛋白羧基末端结合蛋白（CtBP）相联系抑制基因表达[4]。KLF8包含一个特征性的羧基末端DNA结合结构域，其由3个Krüppel样锌指结构组成，KLF8的Pro-Val-Asp-Leu-Ser基序与CtBP作用。KLF8的锌指结构识别DNA序列里的CACCC元件，全长的KLF8蛋白能够抑制CACCC依赖性启动子。最近有研究发现，在某些上皮癌如乳腺癌、卵巢癌、肾癌及肝癌都有KLF8的高表达，且在增强癌细胞的侵袭和转移中起到重要作用[5-8]。但目前其在膀胱癌中的表达情况无相关报道。本研究检测KLF8在膀胱癌患者中表达,分析其表达程度与膀胱癌临床病理之间的关系,及对预后的影响。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2010-03—2011-03我院泌尿外科住院手术治疗患者中的膀胱尿路上皮癌组织137例和同期手术病例的正常组织19例，均经病理证实。所有患者术前均未接受放、化疗（包括膀胱灌注），且排除原位癌。其中男98例，女39例。年龄45～84岁，中位年龄71岁。收集资料包括肿瘤大小、数目、病理分级、分期（依据AJCC2002标准）等。

1.2 主要试剂及方法一抗为多克隆兔抗KLF8抗体（Abnova公司），二抗为生物素标记抗兔二抗（美国DAKO公司）、三抗为辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体（美国DAKO公司）。

1.3 免疫组化采用LSAB方法，组织经4%甲醛固定，石蜡包埋，厚5m，石蜡切片经常规脱蜡水化，EDTA高温修复抗原，PBS漂洗3次后以0.3%过氧化氢-甲醇孵育10min，清除内源性的过氧化物酶活性，PBS漂洗3次后滴加正常山羊血清封闭，室温孵育30min，倾去，滴加1∶100兔抗多克隆抗体，4℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗后，再滴加二抗，室温孵育30min，PBS漂洗3次，再滴加三抗，室温孵育30min，PBS漂洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断 KLF8以胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达，以细胞染色强度和细胞阳性百分率得分之积进行判定，随机选择5个高倍镜视野（×200）进行判断：着色强度无染色记0分，浅黄色计1分,棕黄色计2分，黄褐色计3分，同时对阳性细胞百分比进行评分（0～100%）。上述2项相乘，弱阳性（±）＜50%，中等阳性（++），50%～100%，强阳性（+++），100%～300%。将弱阳性定义为低表达，中等阳性和强阳性为高表达。结果观察在不了解患者临床资料的情况下进行。

1.5 统计学处理采用SPSS11.0软件分析。组间比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法及Logrank检验。

2 结果

2.1 KLF8在膀胱癌组织和正常组织中的表达 KLF8表达阳性主要表现为细胞核中着色（图1），在膀胱癌中KLF8蛋白的阳性表达率为51.8%（71/137），而正常组织为17.6%（3/17），两者比较差异意义有统计学（P＜0.0001）。

2.2 KLF8蛋白的表达与膀胱癌患者临床病理特征及预后的关系 KLF8蛋白的表达与膀胱癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数目等无明显相关性（P＞0.05）；但与膀胱癌的分级、分期及预后有关（P＜0.05）。低级别和高级别膀胱癌中KLF8蛋白表达的阳性率分别为37.2%、58.5%，差异有统计学意义（P=0.021）。非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌中KLF8蛋白表达的阳性率44%和67.4%，差异有统计学意义（P=0.01）。在肌层浸润性膀胱癌中，随访4～103个月，平均48.5个月，Log-rank检验显示，两组间总生存率差异有统计学意义（P=0.0022），KLF8蛋白的阳性表达是影响患者预后的重要因素（图2）。KLF8蛋白的表达与膀胱癌患者临床病理特征的关系见表1。

图1 KLF8蛋白在正常膀胱组织（A）及膀胱癌组织（B）的表达

图2 肌层浸润性膀胱癌中KLF8蛋白低表达和高表达患者的总生存曲线

3 讨论

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，在美国男性恶性肿瘤发病率中占第4位，女性占第7位，在美国2011年新发膀胱癌病例70 530例，其中14 680例死亡[9]。中国临床统计资料显示，膀胱癌发病率在泌尿系统肿瘤中仍处于首位，其中男性发病率为14.72/10万，女性发病率为5.34/10万[10]。在所有初次诊断的患者中，大约75%的患者是非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC），25%的患者是肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）[11]。NMIBC 5年生存率＞90%，但复发率高达60%～85%，其中20%可进展为肌层浸润性肿瘤[12]。MIBC远处转移发生率较高，预后较差。即使及时给予全膀胱切除术治疗和各种辅助治疗，术后5年存活率仅为50%左右[13-14]，并且近30年来MIBC的预后没有明显改善[15]。

表1 KLF8蛋白表达与膀胱癌患者临床病理特征的关系（例）

本研究结果表明，KLF8蛋白在肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织，提示KLF8蛋白可能与膀胱癌的发生有关。KLF8蛋白的表达水平随肿瘤分化水平的降低而升高。NMIBC和MIBC的临床生物学行为有很大的差别，在临床治疗及预后都有明显差别。MIBC中KLF8表达明显高于NMIBC，提示KLF8在膀胱癌的进展中起到一定的作用。因此，临床上通过检测KLF8蛋白的表达，有助于NMIBC和MIBC的鉴别诊断。本研究还发现，KLF8蛋白高表达还与患者的预后有关，为临床患者术后预后提供了生物学指标。已有研究表明，KLF8调控上皮-间质转化在肿瘤的侵袭及转移中起到重要的作用[7]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型的转变，并获得迁移的能力，它是一种基本的病理生理现象，上皮细胞表型的缺失及间质细胞的特性获得是其主要特征。EMT是胚胎发育、组织重建和伤口修复中的基础过程，同时也是肿瘤浸润、转移的一个非常重要的机制[16-17]。因此，我们认为进一步探讨KLF8导致膀胱癌形成的分子机制，有望为判断膀胱癌预后提供一种新的分子生物学指标，同时还可为膀胱癌的靶向治疗提供特异性的靶点。

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Expression of KLF8 protein in bladder cancer and its relation to prognosis

Objective To investigate the expression of KLF8 in bladder cancer and its relation to the prognosis of patients.MethodsThe expression of KLF8 in 137 urothelial bladder cancer and 19 normal bladder tissue samples was detected by immunohistochemistry,and its relation to clinicopathological features was analyzed.ResultsThe positive rate of KLF8 protein was significantly higher in bladder cancer than that in normal bladder tissue(P＜0.001).The positive rate of KLF8 protein was 37.2%in low grade bladder cancer and 58.5%in high grade bladder cancer(P＜0.05).It was significantly lower in non-muscle-invasive bladder cancer than that in muscle invasive bladder cancer(44%,67.4%,P＜0.05).The patient was followed up for 7～112 months,Kaplan-Meier analysis showed that positive expression of KLF8 was significantly associated with overall survival of patients with muscle-invasive-bladder cancer(P＜0.05).ConclusionThe expression of KLF8 protein is high in bladder cancer, which is correlated with classification,TMN stage and prognosis of the disease.

Bladder cancer KLF8 Immunohistochemistry Prognosis