蝎毒抗癌多肽对HL-60细胞凋亡及Bcl-2和p53基因表达的影响

2014-04-13庄海峰郑智茵庄晓芬周郁鸿沈建平

浙江医学 2014年8期

庄海峰郑智茵庄晓芬周郁鸿沈建平

庄海峰郑智茵庄晓芬周郁鸿沈建平

目的研究蝎毒抗癌多肽（APBMV）在体外诱导人急性粒细胞白血病HL-60细胞凋亡的作用及其相关机制。方法采用CCK-8法检测APBMV作用后HL-60细胞的增殖抑制率，光镜观察APBMV作用后HL-60细胞的形态学变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot检测APBMV对相关凋亡基因蛋白表达的影响。结果 CCK-8法显示APBMV能够抑制HL-60细胞增殖，其对HL-60细胞增殖的IC50为15．64μg/ml。流式细胞仪检测提示APBMV能诱导HL-60细胞凋亡，且呈浓度-效应关系。APBMV（16μg/ml）作用48h后，细胞凋亡率为（36．1±2．1）%，与正常对照组比较有统计学差异（P＜0．05）。Western blot提示APBMV（4、8、12和16μg/ml)组的Bcl-2蛋白表达量分别为正常对照组的78．60%、54．60%、25．50%和4．20%；p53蛋白表达量分别为正常对照组的163．00%、271．00%、355．00%和447．00%。结论 APBMV可有效抑制HL-60细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，其机制可能与促进HL-60细胞内p53基因的表达，抑制Bcl-2基因的表达有关。

蝎毒 HL-60 细胞凋亡 Bcl-2 p53

全蝎为钳蝎科动物钳蝎的干燥全虫，中药药典中记载其具有清热解毒，熄风止痉，祛风除湿之功效。河南医科大学生物毒素中心利用分子筛层析技术进一步从东亚钳蝎粗蝎毒中分离提取出了蝎毒抗癌多肽（APBMV）[1]，实验证明APBMV对人乳腺癌MCF-7细胞[2]、前列腺癌DU145细胞[3]、卵巢癌3AO细胞[4]等肿瘤细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用。本实验通过体外实验观察APBMV对人急性粒细胞白血病细胞株HL-60的增殖与凋亡的作用并探讨相关机制，为蝎毒抗癌新药的开发利用提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器 HL-60细胞由浙江中医药大学中心实验室提供，RPMI 1640培养液、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于杭州吉诺生物医药技术有限公司，BCA蛋白含量测定试剂盒、CCK-8试剂盒购于上海碧云天生物技术公司，Bcl-2鼠抗人单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，鼠抗IgG购于北京中杉金桥生物技术公司，吖啶橙（AO）为上海科兴试剂公司产品。多功能酶标仪为美国Thermo Scientific公司产品，流式细胞仪为美国Bio-rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 HL-60细胞的复苏及培养 HL-60细胞复苏后，接种于20ml培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱静置培养，并行台盼蓝拒染实验了解细胞活性。

1.2.2 CCK-8法检测APBMV对HL-60细胞增殖的影响称取APBMV冻干粉5mg，加入5ml D-Hanks液，配制为1mg/ml的母液，12 000 r/min离心10min，取其上清液。使用前用D-Hanks液稀释为4、8、12和16μg/ ml 4个浓度梯度。取对数生长期HL-60细胞，以（1～5）× 108/L的密度接种于96孔板，每孔体积200μl，每组设置3个复孔。分组：（1）溶剂对照组：加入等体积D-Hanks液；（2）实验组：分别加入终浓度分别为4、8、12和16μg/ ml的APBMV；（3）正常对照组：不作任何处理。共培养48h后，每个孔内加入10μl CCK-8试剂，继续培养1h。用酶标仪检测450 nm波长处吸光度OD值。分别计算细胞存活率和增殖抑制率，细胞存活率（%）=（实验组OD值-溶剂对照组OD值/正常对照组OD值-溶剂对照组OD值）×100%，细胞增殖抑制率（%）=[1-（实验组OD值-溶剂对照组OD值）（/正常对照组OD值-溶剂对照组OD值）]×100%。

1.2.3 APBMV作用后HL-60细胞形态学变化配制浓度为1mg/ml的AO母液，临用前稀释为10μg/ml。取对数生长期HL-60细胞，以（1～5）×108/L密度接种于96孔培养板，分别加入不同浓度APBMV（4、8、12和16μg/ ml）20μl，每组各设3个平行孔，培养48h后每孔加入AO 1μl，孵育30min，荧光显微镜下观察。

1.2.4 APBMV对HL-60细胞凋亡的影响细胞分组同上，收集培养48h的HL-60细胞，洗涤离心后调整细胞密度为（1～5）×105/L，先后加入5μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶，混匀后室温避光孵育10min，流式细胞仪检测。

1.2.5 APBMV对HL-60细胞Bcl-2及p53蛋白表达的影响细胞分组同上，4、8、12、16μg/ml APBMV作用48h后，分别收集各组细胞，提取蛋白质，上样检测，化学发光试剂显色，胶片贴近曝光，显影、定影后扫描分析。

1.3 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用方差分析。计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 APBMV对HL-60细胞的增殖抑制作用 APBMV对HL-60细胞具有增殖抑制作用，4μg/ml APBMV作用48h后，HL-60细胞活性为81.00%，增殖抑制率为19.00%；随着药物浓度的增加，抑制率逐渐增加，当药物浓度为16μg/ml时，增殖抑制率为51.53%，不同浓度的APBMV组与正常对照组比较均有统计学差异（均P＜0.05）。APBMV对HL-60细胞增殖抑制的IC50为15.64μg/ml，见表1。

表1 不同浓度APBMV对HL-60细胞增殖的影响

2.2 APBMV诱导HL-60细胞凋亡的形态学观察光镜下正常对照组HL-60细胞呈圆形或椭圆型，APBMV作用48h后，细胞出现凋亡形态学表现，细胞核碎裂，染色质凝集浓染，凋亡小体形成。实验组（4、8、12和16μg/ml APBMV）细胞明显减少，不同浓度APBMV均能抑制HL-60细胞增殖并诱导凋亡，随着APBMV浓度增高，抑制作用也增强，凋亡细胞也相应增多（图1，见插页）。APBMV作用48h后，荧光显微镜下观察可见活细胞核染色质呈现均匀的淡绿色荧光。凋亡细胞体积变小，胞核固缩、边集或碎裂，呈现绿色荧光，并可见凋亡小体（图2，见插页）。

2.3 APBMV对HL-60细胞凋亡的影响正常对照组HL-60细胞凋亡率为（2.5±0.7）%，4、8、12和16μg/ml APBMV作用48h后，细胞凋亡率分别为（9.5±1.2）%、（15.1±2.3）%、（24.3±1.9）%和（36.1±2.1）%，不同浓度实验组与正常对照组比较均有统计学差异（均P＜0.05），说明APBMV能诱导HL-60细胞凋亡，并呈浓度-效应关系（图3，见插页）。

图1不同浓度ABPMV作用后HL-60细胞形态学观察（A：正常对照组；B：4μg/ml组；C：8μg/ml组；D：12μg/ml组；E：16μg/ml组；×200，无染色）

图2 荧光显微镜下观察不同浓度ABPMV作用后HL-60细胞形态学变化（A：正常对照组；B：4μg/ml组；C：8μg/ml组；D：12μg/ml组；E：16μg/ml组；×200，AO染色）

图3 APBMV对HL-60细胞凋亡的影响（A：正常对照组；B：4μg/ml组；C：8μg/ml组；D：12μg/ml组；E：16μg/ml组）

2.4 APBMV对HL-60细胞Bcl-2和p53蛋白表达的影响 4、8、12和16μg/ml APBMV作用48h后，各实验组HL-60细胞中Bcl-2蛋白表达量分别为正常对照组的78.60%、54.60%、25.50%、4.20%；p53蛋白表达量分别为正常对照组的163.00%、271.00%、355.00%和447.00%，不同浓度APBMV组与正常对照组比较均有统计学差异（均P＜0.05），见表2和图4-5。

3 讨论

APBMV并非单一成分的多肽，而是由4组带有不同电荷或电量的多肽组成的混合多肽，既往研究已证实其对多种肿瘤细胞均有抑制增殖和诱导凋亡的作用[2-4]。本研究中CCK-8法检测提示APBMV能够抑制HL-60细胞增殖，同时经形态学观察和流式细胞仪检测证实APBMV能够诱导HL-60细胞凋亡，且随着APBMV浓度增加，抑制细胞增殖和诱导凋亡的能力也增强，抑制作用呈浓度依赖性。

细胞凋亡是生物体基本生命活动之一，与许多生物学过程和疾病的发生、发展有密切的关系。它的作用在于清除机体损伤、衰老或多余的细胞，是维持机体生长发育和自身组织稳定的重要生命现象。当衰老细胞不能通过凋亡机制予以清除时，便可能导致肿瘤发生[5]。Bcl-2、p53是两个重要的细胞凋亡基因。作为凋亡抑制基因，Bcl-2可导致DNA受损的细胞持续存在，抑制其凋亡的发生，从而突变产物聚集，因此Bcl-2过度表达与多种肿瘤的发生密切相关[6-7]。p53基因是一种与人类肿瘤相关的抑癌基因[8-9]，被认为是细胞凋亡过程中不可缺少的重要基因之一。本研究发现，APBMV使HL-60细胞中抑癌基因p53蛋白表达上调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调，可能是蝎毒诱导细胞HL-60凋亡的分子基础之一，但由于中药制剂成分复杂，具体作用机制有待于深入研究和探索。

综上所述，本研究提示APBMV能够抑制HL-60增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与促使p53蛋白表达上调，Bcl-2表达下调有关。本研究结果可为蝎毒的临床应用提供一定的生物学依据，也可为分离、提取其中的有效抗癌成分提供一定的理论依据。进一步的深入研究可从以下几个方面展开：了解国内外对于APBMV的理论研究进展；进行动物实验，进一步证实APBMV的抗肿瘤作用及其相关机制。

表2 APBMV对HL-60细胞Bcl-2和p53蛋白表达的影响

图4 Western blot检测HL-60细胞Bcl-2蛋白表达

图5 Western blot检测HL-60细胞p53蛋白表达

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Effect of anticancer polypeptide in scorpion venom on apoptosis and Bcl-2,p53 gene expression in human leukemia HL-60 cells

ObjectiveTo investigate the effect of antitumor polypeptide extracted from scorpion venom (APBMV)on apoptosis and Bcl-2,p53 gene expression in human leukemia HL-60 cells．Methods APBMV was separated and purified by column chromatography with SephadexG-50,and analyzed by HPLC method．The cultured HL-60 cells were treated with different concentrations of APBMV．The cell growth was assayed by CCK-8 method;the morphological changes of HL-60 cells was observe by microscope,cell apoptosis was measured by flow cytometry,the expression of Bcl-2 and p53 genes was detected by Western blot．Results CCK-8 demonstrated that APBMV restrained HL-60 cells multiplication in a dose-effect manner with a IC50of 15．64μg/ml．Flow cytometer showed that APBMV induced HL-60 cells apoptosis in a dose-effect manner;with APBMV (16μg/ml)for 48h,the apoptosis rate of HL-60 cells was(36．1±2．1)%,significantly higher than that of control group．Western blot showed that APBMV down-regulated the expression of Bcl-2 protein and up-regulated expression of p53 protein．Conclusion APBMV can effectively inhibit the proliferation and induce apoptosis of HL-60 cells,which are associated with up-regulation of p53 and down-regulation of Bcl-2 genes．

Scorpion Venom HL-60 Apoptosis Bcl-2 P53