RP-HPLC法测定食用动物油脂中苯甲酸与山梨酸的含量

符传武，覃子龙

（广西柳州食品药品检验所，广西 柳州 545006）

目前，苯甲酸和山梨酸在我国广泛用作各种食品的防腐剂，有资料表明，其能引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏[1]。因此，国家严格限制其使用量。对食用动物油脂中的苯甲酸、山梨酸含量进行测定，从而对其进行有效监控，不仅关系到消费者的食用安全，还涉及到相关企业的经济效益和市场空间，促进相关产业健康发展。对食品中山梨酸、苯甲酸含量测定的方法主要有气相法[2-6]、液相法[2，7-20]、薄层色谱法[2]和毛细管区带电泳法[21]，但由于食用动物油脂的基体较为特殊，现有的检测方法不能有效控制该样品中苯甲酸、山梨酸的含量。本实验参照了GB/T5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》及GB/T23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》，摸索了食用动物油脂的样品前处理方法。对同时测定食用动物油脂中苯甲酸、山梨酸的含量提出了可靠的方法。此项目在食用动物油脂中的检测目前未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苯甲酸对照品（批号：100419-200301）：购于中国药品生物制品检定所；山梨酸对照品（批号：BW3507-08002）：购于中国计量科学研究所。猪油（检验编号：SP20130215、SP20130177、SP20130338、SP20130474、SP20130465、SP20130396、SP20130419、SP20130494、SP20130521、SP20130543）；牛油（检验编号：SP20130119、SP20130425、SP20130374、SP20130382、SP20130285、SP20130508、SP20130545）分别为柳州、来宾市食品药品监督管理局委托检验样品；甲醇为一级色谱纯（纯度99.9%）：天津四友生物医学技术有限公司；水为Ⅰ级纯化水；其余试剂均为分析纯。

磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）：称取16.72g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和2.72g磷酸二氢钾（KH2PO4），用水溶解后定容至1000mL，即得。

1.2 仪器与设备

Waters1525高效液相色谱仪、紫外检测器：美国Waters公司；AE200型电子分析天平：Mettler Toledo公司；元素820a型摩尔实验室超纯水器：上海摩勒生物技术有限公司；VDRTEX-5旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；LDZ4-1.2型低速自动平衡微型离心机：北京医用离心机厂。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱条件：Wondasil-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（5∶95）为流动相，检测波长为230nm；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；进样量为10μL。

1.3.2 溶液的制备

对照品溶液：分别精密称取苯甲酸、山梨酸对照溶液适量，加磷酸盐缓冲溶液配制成每1mL含苯甲酸、山梨酸为1 000μg的混合溶液作为对照品储备液，再精密量取0.1mL，置于10mL客量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度作为对照品溶液。

供试品溶液：精密称取样品约2g于50mL具塞离心管中，加入10mL磷酸盐缓冲液，用旋涡混合器充分混合，然后4 000r/min离心5min，小心吸出水层转移到25mL容量瓶中，再加入10mL磷酸盐缓冲液于具塞离心管中，重复上述步骤，合并两次水层液，用磷酸盐缓冲液定容至刻度，混匀，用0.45μm滤膜滤过作为供试品溶液。

阴性样品溶液：称取动物油脂（猪油），按照供试品溶液的制备方法，制成苯甲酸、山梨酸的阴性样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性实验及专属性考察

在上述色谱条件下分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。理论塔板数均在3 000以上，分离度大于1.5。苯甲酸保留时间约为10min，山梨酸保留时间约为14min（见图1），样品与阴性样品之间无干扰。

2.2 线性关系

分别精密量取“1.3.2”项下的苯甲酸和山梨酸的混合对照品储备液适量，用磷酸盐缓冲液稀释，制备成含苯甲酸和山梨酸均为0、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL的对照品溶液。分别精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录图谱，以苯甲酸和山梨酸的峰面积（A），分别对其浓度（C，μg/mL）进行线性回归。结果回归方程和相关系数分别为：

表明两者的色谱峰面积与质量浓度在0～320μg/mL范围内均有良好的线性。

图1 阴性对照（A）、样品（B）、苯甲酸和山梨酸混合对照品（C）色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of negative control (A),sample (B)and sorbic acid reference substances (C)

2.3 精密度实验

分别精密量取“1.3.2”项下的苯甲酸和山梨酸的对照品溶液10μL注入液相色谱仪，按上述的色谱条件进行分析，测定其峰面积9次，苯甲酸和山梨酸的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.53%和0.26%。

2.4 回收实验

精密称取已知样品6份，每份约2g，分别加入苯甲酸和山梨酸对照品适量，照“1.3.2”项下供试品溶液配制的方法配制低、中、高3种质量浓度的溶液，并按上述色谱条件下进行测定，计算回收率及RSD，结果见表1。

2.5 重复性实验

按“2.4”项下的的方法制备5份中质量浓度的加标供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，测得苯甲酸和山梨酸含量的平均值分别为0.98mg/g和0.98mg/g；RSD分别为0.88%和0.71%。

表1 回收率测定结果（n=3）Table 1 Determination results of recovery rate

2.6 稳定性实验

取“2.5”项下其中的一份加标供试品溶液在室温条件下放置，在0、3、6、12、24h测定，记录主峰面积，结果表明，峰面积无明显变化，苯甲酸和山梨酸的RSD分别为0.58%、0.43%。

2.7 最低方法检测限

在选定的色谱条件下，取“2.4”项下的低质量浓度的供试品溶液，当信噪比为2时计算其最低方法检测限，结果表明，苯甲酸的最低方法检测限为0.05mg/kg；山梨酸的最低方法检测限为0.05mg/kg。

2.8 样品测定

精密称取17批次的样品，按“1.3.2”项下的方法制备样品溶液；另取“1.3.2”项下的对照品溶液。按上述各自色谱条件，分别注入液相色谱仪10μL，记录色谱图。按外标法以峰面积计算出苯甲酸和山梨酸的含量。其中10批次的猪油（检验编号：SP20130215、SP20130177、SP20130338、

SP20130474、SP20130465、SP20130396、SP20130419、SP20130494、SP20130521、SP20130543）样品均未检出苯甲酸和山梨酸；7批次的牛油（检验编号：SP20130119、

SP20130425、SP20130374、SP20130382、SP20130285、SP20130508、SP20130545）样品中，检验编号为SP20130374的样品检出苯甲酸，其含量为9.7mg/kg；检验编号为SP20130425检出山梨酸，其含量为304.2mg/kg；其他批次的牛油样品中均未检出苯甲酸和山梨酸。

3 讨论

3.1 目前测定苯甲酸和山梨酸国家标准有GB/T5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》及GB/T23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》。食用动物油脂的基体较为特殊，GB/T5009.29—2003检验标准中样品前处理的方法不能满足测定要求；若完全按GB/T23495—2009测定食用动物油中的苯甲酸和山梨酸，则会出现假阴性。故建立本标准来控制食用动物油脂中苯甲酸和山梨酸的含量，以便更好的对食用动物油脂中防腐剂的监测。

3.2 对使用GB/T23495—2009方法测定食用动物油中的苯甲酸和山梨酸出现假阴性的原因进行研究，发现其出现假阴性是由于对照品及样品的制备的过程中所用溶剂不一致造成，建议使用GB/T23495—2009的方法测定含油脂较高的样品时，其对照品溶液的配制使用和样品一样的溶剂。

3.3 建议测定食用动物油脂中的苯甲酸和山梨酸含量时，使用固体对照品。若使用其对照水溶液，则对照水溶液中的溶剂量会改变对照品配制中所用磷酸盐缓冲液的pH值，造成对照品峰与样品峰不一致，但经实验发现，若其对照水溶液的含量与磷酸盐缓冲液的比值控制在1%以内时，则对测定无影响。

3.4 从样品测定的数据推测，由于火锅店需要大量的牛油和羊油，可能会造成不法企业违法向牛油和羊油中添加防腐剂，以便防止油脂的腐化。建议监管部门加大对火锅店中食用动物油脂特别是牛油及羊油的监管力度，同时建议国家尽快出台食用动物油脂防腐剂的使用标准，促进食用动物油脂加工产业健康稳定发展。

3.5 由于本次实验使用的流动相水相占有的比例很大，建议选用亲水性强的色谱柱进行实验，否则会影响苯甲酸和山梨酸之间的分离度且容易损坏色谱柱。在长时间进样过程中，有可能会出现苯甲酸和山梨酸之间的分离度会越来越小，甚至无法分离的情况出现，这是由于大量的水相使色谱柱的亲水性能变弱引起的，只要用有机相（甲醇）把水相完全置换出来就又能获得较好的分离效果。

4 结论

采用反相高效液相色谱法，以Wondasil C18（4.6mm×250mm，5μm）为色谱柱，甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（5∶95）为流动相，检测波长为230nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量10μL，测定食用动物油脂中苯甲酸与山梨酸的含量，回收率和精密度令人满意，方法准确度、灵敏度好、方法检测限较低，完全满足食用动物油脂中苯甲酸与山梨酸的检测需要，同时也为含油脂类较高的食品中苯甲酸与山梨酸的检测提供了参考。

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