枯草芽孢杆菌BJ3-2赖氨酸脱羧酶基因yaaO的克隆与序列分析

唐 雪，蔡传斌，罗信旭，周景瑞，吴拥军*

（贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

假定的赖氨酸脱羧酶（lysine decarboxylase，LDC，EC 4.1.1.18）存在于大多数微生物中，如大肠杆菌（Escherichia coli）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）、尸杆菌（Bacterium cadaveris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。在微生物的合成途径中，LDC可逆的将赖氨酸（lysine）通过脱羧反应生成尸胺[1-2]。该酶是诱导性胞内酶，需要磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate，PLP）为辅酶促进脱羧反应[3]。

尸胺（1,5-戊二胺）是一种多胺，是生物体内广泛存在的具有生理活性的含氮碱[4]。它是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”的主要组成成分，在关闭孔蛋白通道方面起着重要的作用，而且还是反刍兽新月单胞菌（Selenomonas ruminantium）、嗜碱性韦荣球菌（Veillonella alcalescens）、小韦荣球菌（V.parvula）和解脂厌氧弧菌（Anaerovibrio lipolytica）等一些严格厌氧的格兰氏阴性菌的肽聚糖的组成成分之一。虽然尸胺是广泛存在于生物体中的正常物质，对人体没有直接毒害作用，但它也作为一种肉毒胺存在于腐败物中，也会加强酪胺和组胺对人体解毒作用的影响[5]。

贵州水豆豉发酵是通过微生物自然富集发酵传统工艺，发酵期间主要参与的微生物为食品级安全菌株枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。但如果发酵环境控制不当，蛋白腐败也是食品中尸胺的主要来源。豆豉发酵对象大豆富含高蛋白，为控制豆豉发酵过程中过量尸胺的产生，以实验室前期获得的豆豉发酵生产菌株B.subtilisBJ3-2为目标菌株[6]，根据GenBank中B.subtilis168标准菌株的yaaO基因序列设计同源引物，PCR扩增B.subtilisBJ3-2基因组DNA，T克隆得到赖氨酸脱羧酶基因yaaO，测序后与NCBI登录的其他枯草芽孢杆菌yaaO序列进行同源性比对分析，分析LDC酶活性结构域和酶活性位点。从而通过控制LDC的表达，降低豆豉发酵过程中生物胺的含量，对于保障食品安全具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）BJ3-2：本实验室前期分离保存；E.coliDH5α：北京全式金生物技术有限公司；基因组DNA提取试剂盒、pGEM-T载体、溶菌酶（lysozyme）、rTaq酶、T4DNA连接酶、DNA Marker、dNTPs：大连TaKaRa公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini KitⅠ：美国Omega公司。

1.2 仪器与设备

C1000TM Thermal Cycler PCR仪、Universal Hood Ⅱ凝胶成像分析仪、PowerPac HC电泳仪：美国Bio-Rad公司；Mini-6K微型离心机：杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成

根据GenBank登录的B.subtilis168菌株（登录号为AL009126.3）的假定的赖氨酸脱羧酶基因yaaO序列，应用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，引物序列：上游引物P1：5'-ATGAACACACCTTTATATAAAG-3'；下游引物P2：5'-TCATGATTTCTCCTCTTCT-3'；预计扩增片段长度为1 443 bp，由大连TaKaRa公司合成。

1.3.2B.subtilisBJ3-2基因组提取

活化B.subtilisBJ3-2菌株，分离单个菌落，用接种环挑取接种至5 mL的LB液体培养基，于37 ℃摇床140 r/min振荡过夜培养。使用细菌基因组提取试剂盒提取B.subtilisBJ3-2基因组DNA。1%琼脂糖电泳检测基因组的完整性。

1.3.3 目的片段的扩增

以B.subtilisBJ3-2基因组为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、Taq酶0.1 μL 补ddH2O至20 μL。反应程序：94 ℃、5 min，94 ℃、40 s，45.5 ℃、40 s，72 ℃、90 s，30个循环，72 ℃、10 min，12 ℃保存。扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4yaaO的克隆与测序

回收纯化PCR产物，连接pGEM-T载体并转化感受态细胞E.coliDH5α。经菌落和质粒PCR验证后，将阳性重组质粒送至大连TaKaRa公司测序。

1.3.5yaaO序列分析

对yaaO基因的核苷酸及氨基酸Blast进行同源性分析。用BioXM2.6、DNAStar7.1、MEGA5、ClustalX1.81软件对氨基酸保守结构域进行分析并绘制LDC遗传进化树。用Swiss-Model及Deep View Version4.1绘制yaaO蛋白三维结构及标注活性位点。

2 结果与分析

2.1 DNA提取及相关基因的PCR扩增

提取基因组经琼脂糖电泳检测，结果（图1）显示，提取的DNA浓度较高，结构完整，无显著降解，可作为模板进行下一步目标基因的扩增。PCR扩增结果使用2%的琼脂糖电泳进行检测。如图2所示，扩增出一条符合1 443 bp大小预期片段。

图1 枯草芽孢杆菌BJ3-2基因组Fig.1 Genome of Bacillus subtilis BJ3-2

图2 PCR扩增yaaO基因Fig.2 PCR amplification of yaaO

2.2 重组质粒的转化与菌落PCR鉴定

对重组体进行菌落PCR检测，从图3可以看出，约在1 443 bp处有特异性条带出现，与预期基因组PCR扩增yaaO基因的目的条带大小相符，证明获得了阳性的重组菌落。

2.3 阳性菌落的质粒PCR鉴定

将获得的阳性重组菌落接种到液体培养基中进行增菌培养，并提取质粒，进行质粒PCR扩增，结果如图4所示，约在1 443 bp处出现特异性条带，所获得的基因片段大小均与前期PCR扩增产物相吻合，说明目的基因已正确连接到pGEM-T载体内，重组质粒构建成功。将提取的质粒送生物公司测序，并命名为pGEM-yaaO。

图3 菌落PCR鉴定重组子Fig.3 PCR rapid identification of yaaO gene from recombinant clones

图4 质粒PCR鉴定Fig.4 PCR identification of plasmid

2.4 Bacillus subtilis BJ3-2赖氨酸脱羧酶的同源性分析及系统进化树

使用DNAStar软件对测序结果经行分析后表明，B.subtilisBJ3-2赖氨酸脱羧酶基因yaaO的ORF大小为1443bp，共编码480个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。BioXM2.6软件推测目的基因表达的蛋白质分子质量约为53.22 ku，G+C含量为43.59%，蛋白质等电点（pI）为6.23，其中酸性氨基酸19.8%，碱性氨基酸占13.5%。将基因序列提交至美国国家生物技术信息中心（national center of bio-technology information，NCBI）获得基因登录号KJ561349。

将所克隆的目的基因及推测表达的蛋白质序列在NCBI数据库中进行同源性比对分析。结果表明，B.subtilisBJ3-2的yaaO基因与已报道枯草芽孢杆菌的yaaO基因序列和蛋白序列高度同源，都高达91%以上。与B.subtilis168菌株目的基因的基因序列高度同源达94%，yaaO氨基酸序列高度同源达96%。通过与其他枯草芽孢杆菌的（yaaO）的核苷酸序列比对，序列同源性最高的是Bacillussp.JS（yaaO），达到99%；与枯草杆菌其他种（yaaO）序列同源性也在91%以上。表明本实验所克隆的目的基因为赖氨酸脱羧酶基因。

B.subtilisBJ3-2赖氨酸脱羧酶氨基酸序列与芽孢杆菌JS（Bacillussp.JS）同源性最高，为99%。与其他枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）假定的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列同源性都高达91%以上。其中，与B.subtilisE1精氨酸/赖氨酸氨基酸同源性高达96%；与巴氏芽孢杆菌八叠球菌（Sporosarcina pasteurii）的精氨酸/赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶氨基酸序列同源性也高达96%；与B.subtilisMB73/2菌株转氨酶第四家族蛋白（aminotransferase class-V family protein）同源性高达96%；与Bacillussp.BSC154同源性高达95%。

B.subtilisBJ3-2 LDC基因同B.subtilisBJ3-2的精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylation，ADC）一样，同属于PLP依赖型脱羧酶家族的氨基酸保守结构域。作为大多数细菌磷酸吡哆醛（PLP）依赖型脱羧酶的代表——乳酸菌（Lactobacillussp.30a）鸟氨酸脱羧酶家族（ornithine decarboxylase family），具有Ⅲ型PLP型脱羧酶的活性位点、PLP结合位点以及二级结构特征。如图5所示，选择Lactobacillussp.30a的鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）氨基酸序列和B.subtilisBJ3-2的ADC氨基酸序列，对照B.subtilisBJ3-2的LDC氨基酸序列进行比对。如图6所示，选择高度同源的枯草芽孢杆菌其他菌株LDC序列以及李斯特单核细胞增生菌EGD-e菌株（Listeria monocytogenesEGD-e）的LDC作为厚壁菌门代表，结构域不同的大肠杆菌（E.coliATCC 8739）LDC序列作为参比，增加LDC氨基酸序列所特有保守序列及酶活性位点推测的可靠性。

图5 B.subtilis BJ3-2ADC/LDC和Lactobacillus sp.30a ODC的氨基酸多序列比对Fig.5 Amino acid sequence alignments of B.subtilis BJ3-2 ADC/LDC and Lactobacillus sp.30a ODC

赖氨酸脱羧酶作为精氨酸/赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶家族成员之一，该家族又属于吡哆醛磷酸盐（PLP）依赖型天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）超级大家族。从图5和图6对氨基酸脱羧酶结构域分析显示：B.subtilisBJ3-2 LDC与B.subtilisBJ3-2 ADC一样，属于丙氨酸消旋酶家族，在序列的N端含有赖氨酸（单字母缩写为K）的保守序列[AS]-V-[IV]-K-A[DN]-A-Y-G-H-G，几乎在所有丙氨酸消旋酶的氨基酸序列存在[7]。且具有PLP依赖型脱羧酶家族的氨基酸保守结构域，即PLP活性位点，包括[FDSAW]、[RNNHKSVYNSA]、[S-X-H-K]，属于典型的Ⅲ型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。[FDSAW]是所有氨酸转氨酶/氨基酸脱羧酶共有的保守结构域，与蛋白二级结构β-折叠有关。[S-X-H-K]序列中Lys（K）是PLP依赖型脱羧酶的活性位点，PLP通过与Lys氨基酸残基形成醛亚胺键（席夫碱），使酶具有催化活性[8-9]。[RNNHKSVYNSA]序列中的His氨基酸残基改变分子极性作用，是所有脱羧酶及一些其他PLP依赖型酶共有结构域，推测其与催化作用有重要关系[10]。

图6 B.subtilis BJ3-2和其他细菌LDC/ODC的氨基酸多序列比对Fig.6 Amino acid sequence alignments of LDC/ODC of B.subtilis BJ3-2 and other bacteria

从图6可以看出，B.subtilisBJ3-2 ADC、B.subtilisBJ 3-2 LDC与Lactobacillussp.30a ODC中还存在[PGHQGG]、[LGDL]、[GD]、[TYDG]、[SPFYPMYAALD]、[DPNK]、[YPPG]高度保守结构域，与赖氨酸脱羧酶家族推测的保守结构域[PGGXGTXXE]得到印证[11]。与图7相比，[GD]、[TYDG]结构域没有显示出高度保守的结构特征，推测[GD]、[TYDG]结构域可能是鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族（Orn/Lys/Arg decarboxylase family）所特有的保守结构域，而[GSS]是两图对比所共有的结构域，刘艳敏[12]对枯草芽孢杆菌BJ3-2 与其他枯草芽孢杆菌ADC序列同Lactobacillussp.30a ODC 比对发现[PGEK]是B.subtilisBJ3-2 ADC特有的结构域，而[GVPATI]是B.subtilisBJ3-2 LDC与Lactobacillussp.30a ODC特有的结构域，推测该结构域为辅助因子，对鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶的不同代谢的调控具有重要意义。

图7 不同细菌的精氨酸/鸟氨酸脱羧酶氨基酸序列遗传进化树Fig.7 Phylogenetic tree constructed with amino acid sequences of different bacteria LDC/ODC

从图7遗传图谱可以看出，枯草芽孢杆菌LDC均属于遗传距离较近的同一进化分支。B.subtilisBJ3-2的与Bacillussp.JS的LDC的遗传距离最近；与厚壁菌门金黄色酿脓葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）EGD-e的LDC遗传距离次之；与E.coliATCC 8739 LDC以及Lactobacillussp.30a ODC遗传距离最远。以上结果表明，B.subtilisBJ3-2与乳酸菌及其他厚壁菌门细菌的遗传距离接近，具有PLP依赖型脱羧酶家族的氨基酸保守结构域，属于典型的Ⅲ型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族（Orn/Lys/Arg decarboxylase family）成员。

2.5 Bacillus subtilis BJ3-2 LDC蛋白质三维结构预测

使用SWISS-MODEL在线分析[13]，输入Bacillus subtilisBJ3-2 LDC氨基酸序列进行在线蛋白质三维结构预测。结果显示，该蛋白质与数据库里的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus）的鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族蛋白质SAR0482同源性（identity）最高，为39.22%。Deep View Version1.3对该序列进行编辑，预测的蛋白质三维结构，如图8所示，Ser-X-His-Lys是经典的脱羧酶的指纹图谱序列[14]。

图8 B.subtilis BJ3-2 LDC蛋白质三维结构Fig.8 B.subtilis BJ3-2 LDC three dimensional protein structure

3 结论

经多序列氨基酸比对，B.subtilisBJ3-2的LDC包含PLP依赖型脱羧酶家族的氨基酸保守结构域。转氨酶的辅因子为磷酸吡哆素，通过磷酸吡哆醛（PLP）与磷酸吡哆胺（phosphopyridoxamine，PMP）的转化，形成希夫碱中间产物，使一个氨基酸转变为α-酮酸，另一个α-酮酸转变为新的氨基酸[15]。通过对赖氨酸脱羧酶氨基酸的序列分析，推测其鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族保守结构域和蛋白二级结构及酶催化活性位点。从其代谢途径出发，通过分析LDC酶活性结构，为控制豆豉发酵过程中生物胺-尸胺含量，提供一定的理论基础。

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