冷浸渍对赤霞珠干红葡萄酒中黄酮醇物质含量的影响

郭 昱，袁小悦，李斯屿，王振中,2，段长青，何 非*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，葡萄与葡萄酒研究中心，北京 100083；2.中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北昌黎 066600）

适量饮用葡萄酒对人体健康有一定的有益作用，而酚类物质则是葡萄酒活性物质中较为重要的一类[1-7]。近年来的众多研究表明，酚类化合物具有抗氧化，抑制低密度脂蛋白氧化变性，预防冠心病、高血脂病、动脉粥样硬化及抗各种炎症等诸多功能[8-10]。

在红葡萄酒的酿造中，通过皮渣接触（浸渍）工艺，葡萄果实中的一部分酚类物质在酿造过程中逐渐转移到葡萄酒中，极大程度的影响了葡萄酒的感官特性，是构成葡萄酒“骨架”的重要成分[11]。黄酮醇是葡萄及葡萄酒中重要的酚类物质，属于类黄酮化合物，主要包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempefrol）、杨梅酮（myriectin）及其相应的衍生物，多以糖苷态的形式存在，赋予葡萄酒由白到黄的色调，直接或间接的与葡萄酒中的花色苷反应，使葡萄酒的颜色更稳定[12-13]。此外，葡萄酒中的黄酮醇类化合物与唾液中引起收敛感的糖蛋白结合反应，从而影响葡萄酒的口感[14]。

近年来，在葡萄酒酿造过程中浸渍工艺的使用越来越广泛，特别是冷浸渍工艺的研究和使用对葡萄酒质量的提高起到了积极的推动作用[15]。有研究表明，冷浸渍工艺可以促进果皮中的芳香物质的萃取，提高葡萄酒的香气；冷浸渍工艺结合常温发酵可以增加红葡萄酒颜色及黑醋栗风味，增加酚类物质并减少葡萄酒的生青味[16-18]。我国西部产区葡萄酒口感淡薄，颜色容易褪去，而黄酮醇类物质在一定程度上对葡萄酒的这些品质有所影响。因而，研究冷浸渍工艺对干红葡萄酒黄酮醇类物质含量的影响有着重要的意义。本研究从冷浸渍工艺入手，对冷浸渍阶段干红葡萄酒中黄酮醇进行测定和分析，以期为冷浸渍工艺提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯）：美国Fisher公司；乙酸乙酯（分析纯）：北京化学试剂公司；去离子水采用Milli-Q（Milipore，Bedford，MA）系统制备的超纯水。标样槲皮素：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200系列LC-UV-MS仪（配有可变波长检测器VWD）：美国Agilent公司。

1.3 葡萄酒酿造及取样

酿酒所用赤霞珠葡萄果实产自新疆天山北麓，采于2011年10月，葡萄果实完全成熟，所有指标均达到葡萄酒酿造标准（可溶性物质24～25°Bx，总酸度（以酒石酸计）5～6 g/L）。在除梗破碎之前，每串葡萄都经过人工挑选，去除生长状况不好和受伤的葡萄果粒；葡萄破碎入罐后，向150 hL的发酵罐中加入适量的二氧化硫（60 mg/L）。发酵罐均安装有控温和皮渣分离系统：两个发酵罐用作冷浸渍实验，另两个采用传统非控温酿造作为对照组。

1.3.1 传统酿造

加入20 g/hL的商业酿酒酵母L2323（Lallemand Fermented Beverages，Blagnac，France）启动发酵，发酵过程控制在24～26 ℃。酒精发酵至残糖≤4 g/L后终止，随后加入商业乳酸菌LALVIN31（Lallemand Fermented Beverages），启动苹果酸-乳酸发酵。为了提升酚类物质含量，在苹果酸-乳酸发酵阶段进行了21 d的发酵后浸渍。

1.3.2 冷浸渍工艺

酒精发酵前，样品在8～10 ℃的低温环境下浸渍7 d。冷浸渍过程结束后，将发酵罐的温度升高至15 ℃，向葡萄汁中加入与对照组相同的商业酵母启动发酵，其他工艺与传统工艺相同。

1.3.3 样品采集

共采集葡萄酒样品12次：酒精发酵启动当天（实验组即冷浸渍结束时）开始采样，酒精发酵阶段每天采样一次，持续4次；发酵后浸渍阶段每3 d采样一次，持续3次；苹果酸-乳酸发酵阶段每3 d采样一次，持续4次；皮渣分离当天再取样一次。每个发酵罐在取样品前都经过了30 min的泵循环，每个样品取样500 mL，所有样品取出后都放置于-20 ℃的环境中保存。

1.3.4 黄酮醇类物质的分析

采用Agilent 1200系列LC-UV-MS仪分析标准样品和酒样中的黄酮醇类物质。色谱条件：色谱柱，Zorbax SB-C18（3 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；检测波长：280 nm。流动相A：1.0%醋酸水溶液；流动相B：1.0%醋酸甲醇溶液；流速：1.0 mL/min；梯度洗脱程序：0～15 min，10%～26% B；15～30 min，26%～40% B；30～50 min，40%～65%B；50～60 min，65%～95%B；60～63 min，95%～10%B；63～66 min，10%B。离子源为电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI），负离子模式；雾化器压力：206.85 kPa；干燥气流速为10 mL/min；干燥气温度：325 ℃；离子扫描范围为100～1 500 m/z；CID的MS/MS诱导碰撞电压：1.0 V。

1.3.5 数据分析

黄酮醇类物质以槲皮素为标准物进行定性定量分析，每个样品做了两次平行处理。应用SPSS for Windows（v.11.5.）软件One-Way ANOVA邓肯多组极差检验进行数据差异性分析；数据以均值±标准偏差表示；最低显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒酿造各阶段样品理化指标

由表1可知，采收葡萄成熟度基本一致，对照组和实验组在整个酿造过程中，在总糖（以葡萄糖质量浓度表示）、总酸（以酒石酸质量浓度表示）、酒精度上并无明显差别。

表1 葡萄酒酿造各阶段原料和酒的基本理化指标Table 1 Basic physicochemical index of crude material and wine in each stage of wine making

2.2 酒精发酵前样品中黄酮醇类物质的含量

本研究共检测到了13种黄酮醇类物质，分别是槲皮素（quercetin）、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸（quercetin-3-Oglucuronide）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-O-glucoside）、槲皮素-3-O-半乳糖苷（quercetin-3-O-galactoside）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（quercetin-3-O-rhamnoside）、山奈酚（Kaempferol）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-glucoside）、山奈酚-3-O-半乳糖苷（kaempferol-3-O-galactoside）、杨梅酮（myricetin）、杨梅酮-3-O-葡萄糖苷（myricetin-3-O-glucoside）、杨梅酮-3-O-半乳糖苷（myricetin-3-O-galactoside）、异鼠李素（isorhamnetin）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（isorhamnetin-3-O-glucoside）。由于这些物质在葡萄酒中含量较低，故将其分为四大类加以分析，分别为槲皮素类、山奈酚类、杨梅酮类以及异鼠李糖类。

图1～图4中时间为0时即是酒精发酵启动前样品中黄酮醇类物质含量情况，从结果来看，实验组的各类黄酮醇类物质含量普遍高于对照组，其中以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和杨梅酮-3-O-葡萄糖苷、杨梅酮-3-O-半乳糖苷最为明显，实验组的这些物质含量分别高出了对照组21.7 mg/L、10.2 mg/L、66.3 mg/L、12.3 mg/L左右。对于槲皮素、山奈酚、杨梅酮、异鼠李糖四大类物质总量来说，实验组分别高出了对照组31.3 mg/L、3.17 mg/L、82.3 mg/L、3.5mg/L左右，说明发酵前的冷浸渍处理明显有利于原料中黄酮醇类物质的浸出。

2.3 酿造过程中黄酮醇类物质的含量变化趋势

2.3.1 槲皮素类物质含量变化趋势

由图1可知，在整个发酵过程中，5种槲皮素物质在发酵过程结束后的含量均有不同程度上升。后浸渍及苹果酸-乳酸发酵时期，实验组中槲皮素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量明显上升，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量变化不明显，而槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷含量略微下降。但在对照组中，除了槲皮素含量上升外，其余4种物质含量均出现了不同程度的下降。苹果酸-乳酸发酵结束后，除了槲皮素-3-O-鼠李糖苷外，实验组的其余四种物质的含量与对照组相比均有显著性差异，相比于酒精发酵前实验组槲皮素类物质总量高出对照组约31.3 mg/L，这一差距在发酵结束后更加明显，达到49.1 mg/L左右。

图1 2种不同处理的赤霞珠干红葡萄酒中槲皮素类各物质含量变化Fig.1 The content of quercetins in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

2.3.2 山奈酚类物质含量变化趋势

由图2可知，在整个发酵过程中，除了山奈酚含量持续上升外，其他两种物质含量均表现出先升后降的特点。山奈酚物质在葡萄酒中含量并不高，但是从发酵结束后来看，实验组的各类物质含量显著高于对照组。与发酵前相比，两组处理所引起的山奈酚类物质含量上相差并不大，发酵前实验组山奈酚类物质总量高于对照组大约3.1 mg/L，发酵后则高于对照组大约1.5 mg/L。

2.3.3 杨梅酮类物质含量变化趋势

图2 2种不同处理的赤霞珠干红葡萄酒中山奈酚类各物质含量变化Fig.2 The content of kaempferols in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

图3 2种不同处理的赤霞珠干红葡萄酒中杨梅酮类各物质含量变化Fig.3 The content of myricetins in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

杨梅酮类物质在葡萄酒中含量较高，由图3可知，在发酵的整个过程中，实验组和对照组的各类物质含量总的来说表现出上升趋势。在酒精发酵时期，实验组和对照组的各个物质均有明显的上升，而在后浸渍时期，除了实验组的杨梅酮仍在上升，剩下的各个物质含量变化趋于平缓。苹果酸-乳酸发酵结束后，实验组杨梅酮和杨梅酮-葡萄糖苷的含量比对照组高，且具有显著性差异，而杨梅酮-半乳糖苷含量比对照组略微低一些。相比于酒精发酵前，实验组杨梅酮类物质总量高出对照组约82.3 mg/L，这一差距在发酵结束后有所减弱，但两种处理对于杨梅酮类物质含量上的影响在数量上依然明显，实验组高出对照组约50.5 mg/L。

2.3.4 异鼠李素类物质含量变化趋势

图4 2种不同处理的赤霞珠干红葡萄酒中异鼠李糖类各物质含量变化Fig.4 The content of isorhamnetin in Cabernet Sauvignon dry red wines with two different treatments

由图4可以看出，在整个发酵过程中，实验组和对照组各类物质含量均上升，在后浸渍阶段，实验组和对照组的异鼠李素含量还在上升，而异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量则趋于平缓。苹果酸-乳酸发酵结束后，实验组中两种物质的含量均高于对照组且具有显著性差异。此外，两种不同处理在发酵前后对于异鼠李糖类物质总量的影响与山奈酚类物质相似，总的来说是实验组含量高于对照组，但发酵前后两组含量上的差距变化不大，发酵前实验组异鼠李素物质总含量高出对照组约4.5 mg/L，发酵结束后实验组较对照组高出了约5.5 mg/L。

3 结论

本实验研究结果显示，在整个赤霞珠干红葡萄酒酿造过程中，冷浸渍处理的实验组样品黄酮醇类物质在发酵前和结束后含量都要高于没有进行冷浸渍处理的空白组，其中发酵前对照组样品各大类物质含量为槲皮素类15.0 mg/L，山奈酚类0.83 mg/L，杨梅酮类5.7 mg/L，异鼠李素类3.8 mg/L，总含量为25.3 mg/L，实验组样品各大类物质含量为槲皮素类46.3 mg/L，山奈酚类4.0 mg/L，杨梅酮类88.0 mg/L，异鼠李素类7.3 mg/L，总含量为145.6 mg/L，发酵前两组样品总量相差为120.3 mg/L。发酵结束后对照组样品各大类物质含量为槲皮素类74.4 mg/L，山奈酚类3.6mg/L，杨梅酮类154.4 mg/L，异鼠李素类15.6 mg/L，总含量为248.0 mg/L，实验组样品各大类物质含量为槲皮素类123.5 mg/L，山奈酚类5.1 mg/L，杨梅酮类205.1 mg/L，异鼠李素类21.1 mg/L，总含量为345.8 mg/L，发酵后两组样品总量相差为97.8 mg/L，因而总的来说发酵前冷浸渍对于葡萄酒中黄酮醇类物质的浸出有着正面作用，这有利于稳定并改善赤霞珠干红葡萄酒的颜色，并且对于提升葡萄酒的保健作用也有一定的帮助。

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