菟丝子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血浆的药动学特征比较

2014-04-11张学兰赵资堂李慧芬

中成药 2014年2期

关键词：槲皮苷生品菟丝子

王莉，张学兰，赵资堂，李慧芬，刘洋

（山东中医药大学，山东济南 250355）

菟丝子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血浆的药动学特征比较

王莉，张学兰*，赵资堂，李慧芬，刘洋

（山东中医药大学，山东济南 250355）

目的研究菟丝子生品与盐炙品提取物中槲皮苷在大鼠血浆的药动学特征，比较炮制对其吸收代谢的影响。方法大鼠分别灌胃给予生菟丝子和盐菟丝子提取物，于给药前及给药后不同时间点采集血样， HPLC-UV法测定大鼠血浆中槲皮苷的质量浓度，所得数据用 DAS2.1 软件进行药代动力学参数分析。结果血浆中槲皮苷在 0.148 ～29.6 μg/m L范围内线性关系良好，相关系数 r=0.997 0，日内日间精密度均小于 10%，相对回收率在 83.11% ～103.58%，准确度、精密度均符合生物样品的测定要求。生菟丝子和盐菟丝子提取物灌胃后血浆中槲皮苷的主要药动学参数分别为 AUC(0-t)=(10.419 ±0.376) μg/mL· h， AUC(0-∞)=(10.745 ±0.393) μg/mL· h， Cmax=(5.398 ±0.202) μg/m L， t1/2=(1.157 ±0.156)h 和 AUC(0-t)=(16.485 ±0.351) μg/mL·h，AUC(0-∞)=(18.354 ±0.715) μg/mL· h，Cmax=(11.465 ±0.274) μg/mL， t1/2=(1.914 ±0.299)h。结论槲皮苷药动学行为符合二房室模型，盐炙能促进槲皮苷在体内的吸收，并能延缓其体内消除过程，为阐明菟丝子盐炙增效机理提供了科学依据。

菟丝子；盐炙；槲皮苷；血浆药动学； HPLC-UV

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子 Cuscuta australis R. Br.或菟丝子 Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻之功效［1］。黄酮类化合物为菟丝子的主要活性成分，主要有金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素等［2］。药理研究表明，菟丝子总黄酮具有促进成骨细胞活性［3］，抗衰老［4］，增强机体免疫［5］、调节内分泌［6］及保护血管作用［7］。其中槲皮苷具有抗氧化清除自由基［8］，镇静催眠和抗抑郁［9-10］，保护肝脏［11］，抗动脉粥样硬化12］等多种生物学活性。

菟丝子临床主要以炮制品入药，古代对菟丝子的炮制方法主要有炒制、盐炙、制饼、酒炙、酒蒸等，现代主要有盐炙、炒黄等［13］。《中国药典》 2010 年版收载了生菟丝子和盐菟丝子。菟丝子经盐炙后可增强其补肝肾作用，但其盐炙增效机理至今尚不明确。菟丝子盐炙后金丝桃苷量降低，而槲皮素量升高［14］。曾诚等［15］研究了菟丝子灌胃后大鼠血浆中槲皮素的药动学规律。但炮制对菟丝子中槲皮苷的体内吸收代谢有何影响未见报道。本研究采用HPLC-UV法测定菟丝子生品与盐炙品提取物大鼠给药前及灌胃后不同时间点槲皮苷的血药浓度，并计算有关动力学参数，比较菟丝子生品与盐炙品在体内的吸收和代谢差异，为进一步阐明菟丝子的炮制原理及临床合理用药提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器日立 L-2000 型高效液相色谱仪 (日本日立)；FA1604N型电子天平 (精密度为十万分之一，上海精密科学仪器有限公司)； KQ-250E型医用超声波清洗器 ( 江苏昆山市超声仪器有限公司)； PM PLUS 型红外测温仪 (美国 Raytek 公司)； RE-52AA型旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂)； H-1850D台式高速冷冻离心机 ( 湘仪离心机仪器有限公司)； XK96-B快速混匀器 ( 姜堰市新康医疗器械有限公司)。

1.2 试剂和试药菟丝子购自亳州市成源中药饮片有限公司，产地为山东省，经本校中药鉴定教研室周凤琴教授鉴定为旋花科植物菟丝子 Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子。槲皮苷对照品 (中国药品生物制品检定所，批号为111538-200504，供含量测定用)；高效液相用甲醇 ( 色谱纯)；娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物健康 SD大鼠，雌雄不限，体质量 (200 ±20) g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供 ( 许可证号:scxk 鲁20080002)。

2 方法与结果

2.1 菟丝子炮制品的制备生菟丝子: 取原药材，拣去杂质和残留的果梗。盐菟丝子: 取净菟丝子 50 g，加 10%食盐水溶液 10 mL，拌匀，闷润 1 h，置热锅内， 180 ℃ (用红外测温仪测定锅底温度) 炒制 7m in，取出，放凉。成品表面棕黄色，微有裂口，气微香，符合《中国药典》 2010年版盐菟丝子的性状要求。

2.2 灌胃药液的配制分别称取菟丝子生品与盐炙品各50 g，分别加 10、 10、 10 倍量 80%乙醇超声提取 3 次，每次 1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至每 1 mL相当于 2.5 g生药，置4℃冰箱保存，备用。

2.3 给药和血样采集取健康 SD大鼠 12 只，随机分为 2组，即生菟丝子组和盐菟丝子组，每组6只，给药前禁食12 h，自由饮水。灌胃给予菟丝子生品和盐炙品提取液(给药剂量: 生品提取液相当于槲皮苷 32.13 mg/kg，盐炙品提取液相当于槲皮苷 33.39 mg/kg)。分别于给药前及给药后 5、 15、 30、 60、 90、 120、 180、 240、 360 m in 经大鼠眼眶后静脉丛取血，每次 0.5mL，置于 1mL肝素化的离心管中，离心 10 min(4 000 r/min) ，分离血浆，置 -20 ℃冰箱保存，备用。

2.4 测定血浆中槲皮苷 HPLC-UV法的建立

2.4.1 色谱条件［16］KromasiL C18色谱柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为 0.1% 磷酸水-甲醇 (60 ∶40)；体积流量为 1.0 mL/min；柱温 30 ℃；检测波长 350 nm；进样量 20 μL。

2.4.2 对照品溶液的配制精密称取槲皮苷对照品 1.48 mg，加甲醇溶解并稀释至 10 mL量瓶中，得到对照品原贮备液 148 μg/mL，将该贮备液稀释成 14.8 μg/mL的溶液，即得。

2.4.3 血浆样品的前处理及分析取给药前及给药后不同时间点的大鼠血浆各 200 μL，加入甲醇 800 μL沉淀蛋白，涡旋混匀 3min， 12 000 r/min 离心 10min，取上清液备用。精密吸取上述上清液各 20 μL，注入液相色谱仪，色谱图见图1。结果空白血浆样品在待测成分保留时间处无干扰峰，含药血浆样品各色谱峰分离良好。

2.4.4 标准曲线的制备精密量取对照品溶液 2、 10、 20、40、 100、 200、 400 μL，置 10 mL具塞离心管中， 37 ℃空气流吹干，再分别精密加入空白血浆 200 μL，配制成相当于槲皮苷质量浓度为 0.148、 0.74、 1.48、 2.96、 7.40、14.80、 29.60 μg/mL的血浆样品。按照 “2.4.3” 项下方法处理后进样，分别记录峰面积。以血药质量浓度(μg/mL) 为横坐标，以峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得槲皮苷线性回归方程 Y= 6 179.6X+62.041(r=0.997 0)，线性范围为0.148 ～29.6 μg/mL，定量下限为 0.148 μg/mL。

图1 空白血浆（A）、空白血浆加槲皮苷对照品（B）、含药血浆（C） HPLC图

2.4.5 精密度试验精密吸取大鼠空白血浆 200 μL，按“2.4.4” 项下的方法制备高、中、低 3 个质量浓度的血浆样品 (29.6、 2.96、 0.148 μg/mL)，每个质量浓度的样品制备 6 份，按 “2.4.3” 项下方法处理，当天对样品进行测定，评价日内精密度。重复测定3 d，以当日的标准曲线标定血浆样品的质量浓度，评价日间精密度，结果日内精密度 RSD分别为 4.9%、 2.2%、 1.9%，日间精密度 RSD分别为 5.3%、 5.1%、 3.7%。

2.4.6 稳定性试验取大鼠空白血浆 200 μL，按“2.4.4” 项下的方法制备高、中、低 3 个质量浓度点的血浆样品 (29.6， 2.96， 0.148 μg/mL)，每个质量浓度的样品制备 6 份，按 “2.4.3” 项下方法处理，室温下放置，于制备后 0、 2、 4、 8、 10、 12 h 进样测定，计算 RSD值， 3个质量浓度的 RSD值分别为 3.60%、 2.04%、 2.43%，表明标准血浆样品室温放置12 h稳定性良好。

2.4.7 回收率试验精密吸取大鼠空白血浆 200 μL，按“2.4.4” 项下的方法制备高、中、低 3 个质量浓度的血浆样品，每个质量浓度的样品制备 6 份，按 “2.4.3” 项下方法处理，根据标准曲线计算槲皮苷量，测得值与理论值相比得相对回收率，结果见表1。

2.5 菟丝子生、制品中槲皮苷的药代动力学参数计算及结果将测得的血药质量浓度数据运用 DAS 2.1 软件按照非室模型进行拟合计算，结果表明，大鼠灌胃给予生、盐菟丝子提取物后槲皮苷在大鼠体内的药动过程符合二室模型；槲皮苷在大鼠体内的主要药动学参数见表2，其平均血药质量浓度-时间曲线见图 2。

3 小结与讨论

3.1 通过 DAS 2.1 软件房室模型分析，生菟丝子、盐菟丝子提取物灌胃后大鼠血浆中槲皮苷的吸收代谢过程均符合二室模型。分析药动学参数发现，大鼠灌服菟丝子生、制品提取物后，槲皮苷药时曲线下面积 AUC(0-t)、 AUC(0-∞)、达峰浓度 Cmax，均为盐炙品＞生品，盐炙品与生品比较，有显著性差异，说明盐炙能促进槲皮苷的吸收。消除半衰期 t1/2z: 盐炙品＞生品，盐炙品与生品比较，有显著性差异，说明盐炙能延缓槲皮苷在体内的消除。

表1 大鼠血浆中槲皮苷的相对回收率试验结果

表2 菟丝子生品与盐炙品灌胃后槲皮苷的药代动力学参数比较（ n=6， ¯）

注: 盐炙品与生品比较，*P＜0.01；相对生物利用度 F= AUC(0-t)盐· D生/AUC0-t)生· D盐×100%=152.30%， D为给药剂量

参数单位生菟丝子盐菟丝子AUC(0-t)μg·mL-1·h10.419 ±0.37616.485 ±0.351*AUC(0-∞)μg·m L-1·h10.745 ±0.39318.354 ±0.715*AUMC(0-t)μg·m L-1·h218.108 ±0.76629.822 ±1.109 AUMC(0-∞)μg·m L-1·h220.618 ±1.18646.406 ±6.746 MRT(0-t)h1.738 ±0.0171.809 ±0.052 MRT(0-∞)h1.918 ±0.0652.521 ±0.283 VRT(0-t)hˆ21.564 ±0.0642.244 ±0.133 VRT(0-∞)hˆ22.653 ±0.4127.325 ±2.096 t1/2zh1.157 ±0.1561.914 ±0.299*Tmaxh0.50.5 Cmaxμg·mL-15.398 ±0.20211.465 ±0.274*

图2 菟丝子生品与盐炙品提取物中槲皮苷平均药时曲线比较（ n=6， ¯）

3.2 前期曾采用 HPLC法测定菟丝子生品与盐炙品粉末(4 号筛) 中槲皮苷，结果生品为 0.056%，盐炙品为0.030%，盐炙后槲皮苷量降低 46.56%，测定菟丝子生品与盐炙品 80%乙醇提取物中槲皮苷提取量，结果生品为0.040%，盐炙品为 0.042%，说明盐炙利于成分的煎出。本实验在菟丝子生品与盐炙品提取物中槲皮苷量相近的情况下，比较菟丝子盐炙品与生品中槲皮苷的生物利用度，结果盐炙品约为生品的 1.5 倍，说明盐炙可提高菟丝子中槲皮苷的生物利用度，为菟丝子盐炙增效提供了科学依据。

3.3 曾对菟丝子炮制品提取物中金丝桃苷进行测定，由于金丝桃苷主要存在于菟丝子种仁里，提取物中金丝桃苷量很低，在给药剂量80 g/kg时，大鼠血浆中仍未检出金丝桃苷色谱峰，故未对其进行测定。

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R969.1

:1001-1528(2014)02-0401-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.044

2013-02-18

国家科技重大专项-“重大新药创制” -“山东省重大新药创制中心建设” (2009ZX09301-013)

王莉 (1987—) ，女，硕士生，主要从事中药炮制与中药新药研发。 Tel:15064148485， E-mail:wangliwl1987@126.com

*通信作者: 张学兰 (1963—) ，女，教授，硕士，主要从事中药炮制与中药新药研发。 Tel:13406062766， E-mail:zhang8832440@sina.com

日期:2013-10-23