实验设计-响应面法优化大叶当归中阿魏酸的闪式提取工艺

许代福，方应权

(重庆三峡医药高等专科学校，重庆万州 404020)

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，具有调经止痛，活血补血的功效［1］。大叶当归(A.megaphylla)是我国特有的伞形科当归属植物，分布于四川等地，在三峡库区的巫溪、巴东、石柱和巫山等地区尤为常见，当地民间常用作当归的代用品。本品含有与正品当归相同的藁本内酯、挥发油、阿魏酸等活性成分［2-3］。阿魏酸 (ferulic acid)作为大叶当归的主要活性成分之一，具有抑制血小板聚集、抗血栓、抗心肌缺血、抗氧化，抗癌等作用。此外，阿魏酸在食品、医药、化妆品及添加剂等领域均有广泛的用途［4-6］。阿魏酸的传统提取方法包括渗漉法［7］、乙醇回流法［8］和超声提取法［9］等。这些方法存在能量消耗大、所需溶剂多，操作时间长等缺点。现代提取方法如超临界CO2萃取法［7］、加速溶剂萃取法［10］以及微波辅助提取法［11］等用于提取当归中的阿魏酸也已见文献报道，但这些方法也存在设备成本高，能耗大等缺点。

闪式提取法，又名组织破碎提取法，是近年来发展起来的一种新型提取技术，具有高效、迅速和节能等优点［12-13］，该方法利用高速剪切力和超分子渗滤技术在短时间内将药材粉碎至细微颗粒，使药材中有效成分迅速达到溶解平衡，从而实现高效提取。本实验首次采用实验设计结合响应面法优选闪提法提取大叶当归中阿魏酸的工艺条件，并与传统的提取方法进行比较。

1 仪器与材料

Agilent 1200系列高效液相色谱仪，Agilent ChemStation B.04.02工作站 (美国安捷伦公司);JHBE-50S型中草药闪式提取器 (河南金鼎科技发展有限公司);RE 52-86A旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);Millipore simplicity-185超纯水器 (美国密里博公司);Sartorius BS110S分析天平(北京赛多利天平有限公司)。

大叶当归，采自巫溪大宁河畔1500米高山上，由三峡中药研究所付绍智教授鉴定为A.megaphylla的根。阿魏酸对照品 (中国食品药品检定研究院提供，批号110773-200611);甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 大叶当归中阿魏酸测定方法 参考文献［1，14］，测定大叶当归中阿魏酸的量。色谱条件为:安捷伦 SB C18高效液相色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水-磷酸 (30∶70∶0.3)为流动相;检测波长为316 nm;体积流量为1.0 mL/min;柱温35℃;进样量20 μL;在1.98～99.00 μg/mL范围内阿魏酸质量浓度与峰面积呈线性关系(r=0.9999);精密度RSD＜0.96%;平均加样回收率为97.26%，RSD为1.75%。

2.2 实验设计

2.2.1 考察因素和水平的确定 参考相关文献报道及前期预试验结果［9-11，15］，采用甲醇或乙醇提取当归中阿魏酸的效果较好，考虑安全因素，本研究选用乙醇为溶剂，并保持粉末粒径为粗粉，闪提工作电压120V，考察乙醇体积分数、乙醇体积 (液料比)和提取时间对提取得率的影响。

取干燥大叶当归根茎，干燥，制成粗粉 (20目)，称取20 g，进行闪式提取，提取完成后过滤提取液，滤液加70%甲醇-盐酸 (100∶1)稀释至500 mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇-盐酸 (100∶1)补足质量，摇匀，静置，取上清液，以0.45 μm孔径滤膜滤过，按“2.1”项测定阿魏酸的含有量，以阿魏酸得率作为考察指标，采用单因素法考察乙醇体积分数、料液比和提取时间对闪式提取的影响。结果显示，当15倍量 (v/m)65%乙醇提取时间80 s时，闪式提取大叶当归中阿魏酸得率较高。

2.2.2 Box-Behnken实验设计及响应面分析 选取影响闪式提取工艺的三个因素，即乙醇体积分数 (x1)，乙醇体积倍数 (x2)，提取时间 (x3)为考察因素，以阿魏酸得率(Y)为响应值，进行Box-Behnken试验，各因素取3水平，分别记为－，0，+，各因素和水平编码及实际值见表1，实验方案及结果见表2。

表1 Box-Behnken试验因素水平

表2 Box-Behnken试验结果

采用 Design Expert 7.0.0(Stat-Ease Inc.Minneapolis)软件对表2中不同试验条件下所得到的阿魏酸收率进行回归分析，得拟合方程:

其中Y为响应值，βi代表不同的回归系数，应用统计分析软件Design Expert 7.0.0对数据进行多元回归和方差分析，结果如表3所示。

表3 Box-Behnken实验设计方差分析

可见考察因素与响应值之间呈二次二项式模型，该模型呈现统计学极显著意义 (P=0.001)。因素x1、x2和x3对响应值 (得率)均具有显著影响;各因素交互作用项中，乙醇倍数 (x2)与提取时间 (x3)的交互作用对阿魏酸得率的影响呈现统计学显著意义，其它交互作用项的作用不显著;各因素的二次项对响应值都具有显著性影响。为简化方程求解，在保证拟合度的前提下，进行了相应的方程简化，在P＜0.1水平上拒绝无显著相关的项目后，响应值与试验因素的拟合方程为:

上述方程中，模型P＜0.001，表明建立的模型具有极显著意义，校正决定系数 (Adj.R2)为0.9816，说明该方程拟合程度好。模型失拟值 (lack of fit)检验结果为:F值为3.09，P=0.2625，即模型失拟不具有统计学显著意义［16］。各因素与响应值的3D响应面和等高线图见图1。剂消耗的综合作用，其公式如下:

图1 乙醇体积分数、乙醇体积和提取时间对阿魏酸提取得率作用的响应面 (3D)和等高线图

其中，pi为响应值的权重;n为响应值的数目;di为单个响应值的渴求函数。D值在0～1之间，D值越接近1则说明所确定的最优条件越接近全局最优条件。本研究设响应值目标为:得率最高，溶剂消耗最少，其中以得率为主要目标，因此本实验阿魏酸得率权重取10，乙醇体积分数和乙醇体积倍数权重均取1。利用Design-Expert软件整合渴求函数的计算功能，得最大化总体渴求值 (D)为0.796，因素的最佳水平组合为:乙醇64%，体积为药材13倍(v/m)，提取时间100 s。在此工艺条件下，根据模型预测阿魏酸得率为0.0299%。

为验证优选工艺的可靠性和模型的预测性，取大叶当归30 g，按最优工艺进行闪式提取，平行操作3份，按“2.1”项下测定，阿魏酸得率均值为0.0292%，RSD为1.20%，与模型预测值的偏差为－2.31%。表明该工艺稳定可行，具可操作性和重复性，且模型预测性好。

2.4 与其他提取方法的比较 根据文献［7-9］，分别采用渗漉法、乙醇回流法和超声提取法提取大叶当归中的阿魏酸，每种方法重复3次，结果见表4。

表4 提取方法比较

3 讨论

近年来，实验设计 (design of experiment，DoE)结合响应面法 (response surface methodology，RSM)在中药提取和制备中应用日益广泛［17-18］。本研究在参考文献和前期实验的基础上，通过实验设计-响应面法，结合计算渴求函数值，得到了闪式提取大叶当归中阿魏酸的最佳工艺条件，药材制成粗粉 (20目)，以13倍 (m/V)的64%乙醇为提取溶剂，工作电压120 V，提取时间100 s。该方法操作简单稳定，重现性好，提取率较高。

比较闪式提取法和传统提取方法可见 (表4)，乙醇回流法得率高，但液料比也高，闪提法和超声辅助提取法的溶剂消耗量比较接近，为乙醇回流法的一半左右，得率分别为乙醇回流法的92.1%和89.9%。渗漉法溶剂消耗最少，但提取前需要浸泡2 d，因此操作时间最长，得率也相对较低。闪提法在提取时间上具有明显优势，超声辅助提取法、乙醇回流法和渗漉法所需时间分别是其30倍、108倍和2160倍。综合考虑，闪提法不失为提取大叶当归中阿魏酸的一种良好方法。

从实验和文献［9，12，14］中可以看到，大叶当归中阿魏酸的含有量低于正品当归，因此在使用上，可适当增大中药的用量，以保证治疗效果。而大叶当归中其它有效成分的量也有待于进一步考察，以保证用药安全。

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