七叶鬼灯檠总酚微波辅助提取工艺优化及其DPPH自由基清除能力分析

孙 婷，姚 佳，肖娅萍

(药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范大学生命科学学院，陕西西安 710062)

七叶鬼灯檠 (Rodgersia aesculifolia Batalin)是虎耳草科 (Saxifragaceae)鬼灯檠属多年生草本植物［1］。以根茎入药，药材称为索骨丹。其药用历史悠久，具有清热解毒、止泻、止血、生肌等功效，主治跌打损伤，月经不调和风湿性关节炎等［2-3］。七叶鬼灯檠的根茎含蒽醌苷、强心苷、淀粉、糖类、鞣质［4］，入药可治疗湿热下痢、久泻、便血、疮毒等［5］。七叶鬼灯檠含有岩白菜素、儿茶素、没食子酸、熊果苷等酚酸类化合物，均有很强的生理和药理活性［6-7］。目前研究报道较少，多数集中在主要成分岩白菜素的研究，也有部分该属植物的化学成分研究，随着研究的不断深入，鬼灯檠属植物中更多的活性物质以及生物学活性有待于发掘。

微波辅助萃取技术 (microwave-assistedextraction，MAE)，是将被萃取的原料浸于溶剂中，利用微波能使原料中的化学成分迅速溶出萃取的方法。具有选择性高、能耗低、效率高、污染小并且对成分破坏小等优点，已被广泛用于药用植物有效成分的提取。本研究拟采用单因素试验法，分别考察微波辅助下微波功率、乙醇体积分数、料液比、提取时间等不同因素对总酚提取率的影响，并在单因素基础上进行正交试验，以确定七叶鬼灯檠总酚的最佳提取工艺方案。同时，我们还对其总酚成分清除DPPH自由基能力进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料 七叶鬼灯檠于2010年8月采自陕西宁陕县旬阳坝，经陕西师范大学生命科学学院田先华教授鉴定为虎耳草科鬼灯檠属植物七叶鬼灯檠Rodgersia aesculifolia Batalin。称取七叶鬼灯檠干燥根茎250g，粉碎后过40目筛，备用。

1.2 试剂与仪器 没食子酸对照品 (100mg，中国药品生物制品检定所);Folin-Phenol，无水乙醇 (天津市河东区红岩试剂厂);亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯 (天津北方天医化学试剂厂);丁基羟基茴香醚 (BHT)和1，1-二苯基苦基苯肼 (DPPH)购自Sigma公司;蒸馏水、超纯水为本实验室自制。

MAS-Ⅱ型常压微波催化合成/萃取仪 (上海新仪微波化学科技有限公司);RⅡ旋转蒸发仪 (上海豫康科教仪器设备有限公司);UV-2450紫外可见分光光度计 (岛津(香港)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 总酚酸含量的计算 参照Folin-Ciocalteu法［8-9］测定七叶鬼灯檠中总酚酸含量。

1.3.2 单因素试验 微波功率 将材料用70%乙醇按料液比1∶30预浸泡30 min，提取温度65℃，提取时间5 min，分别在微波功率为300、400、500、600、700 W对样品进行总酚提取。

乙醇体积分数 将材料分别用20%、30%、40%、50%、60%的乙醇在料液比为1∶30预浸泡30 min，提取最佳功率500 W，提取温度65℃，提取时间5 min进行总酚提取。

料液比 将材料用上面最佳乙醇体积分数，按料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70分别进行预浸泡30 min，提取最佳功率500 W，提取温度65℃，提取时间5 min进行总酚提取。

提取时间 在最佳微波功率500 W，乙醇体积分数40%和料液比1∶30的条件下，浸泡30 min，提取时间分别为4、6、8、10、12 min进行总酚提取。

1.3.3 待测样品总酚提取率的计算 吸取适量样品溶液，样品中总酚浓度通过没食子酸标准曲线公式进行计算。按下式计算总酚提取率，每组试验重复3次。总酚提取率(%)=浓度×提取液体积/原料干重×100%

1.3.4 总酚DPPH自由基清除率的计算 称取七叶鬼灯檠总酚微波辅助最佳工艺提取物以及阳性对照BHT，用甲醇配制成质量浓度为120 μg/mL的样品溶液。将配制好的样品溶液分别稀释成90、60、30、15、9 μg/mL。用甲醇配制质量浓度为80 μg/mL的DPPH自由基溶液。

以甲醇为空白在波长517 nm处测定其吸光度A作为对照。另取0.1 mL不同质量浓度的七叶鬼灯檠总酚 (9、15、30、60、90、120 μg/mL)与3 mL 0.08 mmol/L DPPH 自由基摇匀，在黑暗条件下放置30 min，以无水乙醇为空白在波长517 nm处测定其吸光度 (A样品)。并按照以下公式计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率 (%)=(A对照－A样品)/A对照×100

2 结果与讨论

2.1 没食子酸标准曲线的绘制 称取10.0 mg没食子酸对照品，用甲醇溶解为100 μg/mL的没食子酸对照品溶液。分别吸取对照品溶液0.1、0.2﹑0.3﹑0.4﹑0.5﹑0.6 mL于10 mL量瓶中，并补充适当甲醇至1.0 mL。再各加入0.5 mL福林酚溶液，3 min后，分别加入1.5 mL，0.2 g/mL Na2CO3溶液，然后用去离子水定容至10.0 mL，混匀后静置2 h，以水作空白，在波长760 nm处测定其吸光度。以吸光值A为纵坐标，质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.1063x+0.0277，R2=0.9994，质量浓度在1～6 μg/mL之间线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 微波功率对提取率的影响 微波功率对提取率的影响结果如图1所示，结果表明，总酚提取率随微波功率的增大而增加，在500 W时达到最高值，之后略有下降。因此，选择500 W作为最佳微波功率。

图1 微波功率对总酚提取率的影响

2.2.2 乙醇体积分数对提取率的影响 不同乙醇体积分数对提取率的影响如图2所示，结果表明，当乙醇体积分数从20%升到30%时，总酚提取率大幅上升;乙醇体积分数由30%升到40%时，总酚提取率上升趋势缓慢;当乙醇体积分数为50%时，七叶鬼灯檠总酚提取率最高，之后开始下降，所以选择体积分数为50%的乙醇作为提取最佳溶剂。

图2 乙醇体积分数对总酚提取率的影响

2.2.3 料液比对提取率的影响 料液比对多酚提取率的影响如图3所示，结果显示，料液比为1∶30时总酚提取率值最大，之后提取率下降，故选择料液比为1∶30。材料使用小于1∶30的料液比时，溶剂与材料反应较剧烈，会喷溅不易操作，所以料液比选择从1∶30开始。

图3 料液比对总酚提取率的影响

2.2.4 提取时间对提取率的影响 提取时间对提取率的影响见图4，结果表明，随着提取时间的延长，总酚的提取率逐渐增加，在时间为8 min时达到最大值，之后开始逐渐下降。因此，选8 min为最佳提取时间。

图4 提取时间对总酚提取率的影响

2.3 正交试验 根据单因素实验结果，选取提取时间、料液比、微波功率、乙醇体积分数作为微波提取的因素，选择正交表设计四因素三水平优化七叶鬼灯檠总酚微波辅助提取的工艺。结果见表1。

表1 正交试验

由表1可知，得率最高的一组为第4组，即A2B1C2D3时总酚提取率达到最大值，4种因素对总酚提取率影响的顺序为料液比 (B) ＞乙醇体积分数 (D) ＞提取时间(A)＞提取功率 (C)。极差分析结果表明，最佳提取工艺为A1B1C3D3，即提取时间为6 min、料液比为1∶30、功率为600 W、乙醇体积分数50%。由于C组R值最小，所以以C组功率为误差列统计软件SPSS17.0方差分析结果显示，料液比P值为0.002小于0.01，表明料液比对得率的影响具有极显著性差异;乙醇体积分数和时间的P值分别为0.078和0.122均大于0.05，表明乙醇体积分数和时间对得率的影响不显著，极差分析和方差分析结果一致。由于提取时间和提取功率对得率影响不显著，综合考虑，提取时间选取6 min，提取功率选取500 W，料液比为1∶30、乙醇体积分数为50%，即最佳组合为A1B1C2D3。对正交试验得到的最佳总酚提取工艺进行验证试验，结果如表2所示。可以得出，250 g的七叶鬼灯檠干燥根茎在最佳工艺优化条件下得到的提取率为8.07%。

表2 最佳工艺验证结果

2.4 DPPH自由基的清除能力 从图5可知，不同质量浓度的七叶鬼灯檠总酚提取物对DPPH自由基均具有较强的清除能力，随着提取物浓度的增大，对DPPH自由基的清除率也增加。在终质量浓度为120 μg/mL时，阳性对照BHT的清除率为98.51%，七叶鬼灯檠的微波辅助最佳总酚工艺的提取物对DPPH自由基的清除率为98.03%。自由基清除率为50%时的浓度称为半清除率浓度，用IC50表示。IC50值越小说明对达到半清除率时所需的浓度就越小，也就是自由基清除活性越强。

七叶鬼灯檠总酚提取物对DPPH自由基均有清除作用，并且其微波总酚提取物的IC50(12.20±1.60)μg/mL小于BHT的IC50(13.60±1.10)μg/mL，显示了七叶鬼灯檠总酚提取物具有较强的抗氧化活性。特别此工艺优化下提取物清除自由基的能力要好于BHT，且由于其是天然抗氧化物质，毒性小，相对于人工合成的抗氧化剂而言，具有很大的开发潜力以及很好的应用前景［10］，见图5。

图5 BHT和七叶鬼灯檠不同提取物对DPPH自由基的清除率

2.5 讨论 微波萃取可广泛应用在中草药、食品、化妆品等领域［11-12］。近年来在天然产物提取中有较多应用。己有较多文献报道微波用于中草药中酚酮类成分的提取。微波萃取技术与传统方法相比节约了时间，同时得率也有所提高［13］。微波辅助萃取具有选择性高、能耗低、效率高、污染小并且对成分破坏小等优点，在植物的成分提取上已经有广泛的应用。微波辅助提取已广泛应用于黄姜色素提取［14］、马钱子中总生物碱的提取［15］、板蓝根总有机酸的提取［16］、猕猴桃根的多糖提取［17］、玫瑰花的总黄酮提取［18］等多种植物成分的提取。表明微波辅助萃取法在植物有效成分提取方面的应用比较多。

植物多酚是以苯酚为基本骨架的多羟基酚类化合物的总称，存在于植物的叶、皮、壳和果肉中［19］。随着研究的不断深入，人们发现植物多酚具有抗氧化、抗衰老、抗炎、防辐射和降血压等生物学活性［20］。植物多酚在医药、生物化学以及食品等领域的研究被受关注，对多酚类物质的提取方法也在不断的改进［21］。

七叶鬼灯檠中多酚含量较高，本试验通过微波辅助对七叶鬼灯檠总酚进行了萃取，提取效率高，稳定性好，操作简便。为七叶鬼灯檠多酚类物质的提取提供一定的参考。实验结果表明七叶鬼灯檠多酚提取物具有很强的抗氧化活性，而且是天然抗氧化物质，毒性小，相对于人工合成的抗氧化剂而言，具有很大的开发潜力以及很好的应用前景，值得进一步开发利用和研究。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1992.

［2］刘 毅，陈羲之.云南常用中草药单验方荟萃［M］.昆明:云南科学技术出版社，2007:129.

［3］广西药用植物园.药用植物花谱［M］.重庆:重庆大学出版社，2009:157.

［4］陈发奎.中药有效成分含量测定［M］.北京:人民卫生出版社，2007:1500.

［5］潘锦堂.鬼灯檠属的系统发育、分类和地理分布［J］.植物分类学报，1994，32(4):316-327.

［6］史彦斌，胡振英，董鹏程，等.中草药鬼灯檠的现代研究进展［J］.时珍国医国药，2004，15(9):77-78.

［7］沈序维，郑尚珍.鬼灯檠化学成分的分离和鉴定［J］.高等化学学报，1987，8(6):528.

［8］Kelen M，Tepe B.Chemical composition，antioxidant and antimicrobial properties of the essential oils of three Salvia species from Turkish flora［J］.Bioresour Technol，2008，99(10):4096-4104.

［9］Yaltirak T，Aslim B，Ozturk S，et al.Antimicrobial and antioxidant activities of Russula delica Fr［J］.Food Chem Toxicol，2009，47(8):2052-2056.

［10］刘 畅，周家春.植物多酚抗氧化性研究［J］.粮食与油脂，2011(2):43-46.

［11］傅荣杰，冯 怡.微波萃取技术在中药及天然产物提取中的应用［J］.中国中药杂志，2003，28(9):804.

［12］高彦祥，何 宁.微波萃取技术及其在食品工业中的应用［J］.食品与机械，1997(6):39-40.

［13］孙美琴，彭超英.微波萃取技术［J］.广州食品工业科技，2003，19(2):96.

［14］陈 合，李世玉，王利红，等.微波辅助提取黄姜色素的研究［J］.食品工业科技，2010，31(3):285-289.

［15］邹建国，刘 飞，罗 平，等.微波辅助提取马钱子中总生物碱工艺［J］.食品科学，2010，31(18):116-118.

［16］雷黎明，蒋云凯，高 倩，等.正交试验优选微波法提取板蓝根总有机酸的工艺［J］.中国药房，2008，19(24):1866-1867.

［17］李加兴，李敏利，刘 飞，等.微波辅助提取猕猴桃根多糖工艺优化［J］.食品科学，2010，31(4):42-45.

［18］周 达，罗 成，鲁晓翔.玫瑰花总黄酮微波辅助提取及其抗氧化研究［J］.食品工业科技，2010，31(4):269-272.

［19］宋立江，狄 莹，石 碧.植物多酚研究与利用的意义及发展趋势［J］.化学进展，2000，12(2):161-162.

［20］赵扬帆，郑宝东.植物多酚类物质及其功能学研究进展［J］.福建轻纺，2006(11):107-110.

［21］林樱姬，赵 萍，王 雅.植物多酚的提取方法和生物活性研究进展［J］.陕西农业科学，2009(6):105-107.