酶解辅助提取金芪降糖片中生物碱的工艺研究

南 楠， 宁 娜，2， 孟利娜， 谢宪斌， 周 晶*， 王 欣

（1.天津医科大学药学院， 天津市临床药物关键技术重点实验室， 天津 300070； 2.贵州省铜仁职业技术学院药学系， 贵州 铜仁 554300； 3.天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂， 天津 300457）

酶解辅助提取金芪降糖片中生物碱的工艺研究

南 楠1， 宁 娜1，2， 孟利娜1， 谢宪斌1， 周 晶1*， 王 欣3

（1.天津医科大学药学院， 天津市临床药物关键技术重点实验室， 天津 300070； 2.贵州省铜仁职业技术学院药学系， 贵州 铜仁 554300； 3.天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂， 天津 300457）

目的 考察酶解辅助提取技术对金芪降糖片中生物碱提取率的影响，优选出生物碱的最佳提取工艺条件。方法采用正交试验， 考察酶用量， pH， 温度以及酶解时间对金芪降糖片中生物碱提取率的影响。 结果 优化酶解法的最佳提取工艺条件为： 加入相当于药材质量 0.6%的纤维素酶， 在 pH4.5， 35 ℃条件下酶解 3.0 h， 可将小檗碱提取率提高 29.98%， 黄连总生物碱提高 30.17%。 结论 酶解-冷浸法提取黄连生物碱简便可行， 不仅生物碱浸出率高，而且适合工业化生产。

酶辅助提取；金芪降糖片；生物碱；小檗碱；正交试验

金芪降糖片是治疗非胰岛素依赖性糖尿病的经典方剂，由黄连、金银花和黄芪3味药组成，其中主要成分为四大类： 生物碱类、 有机酸类、 黄酮类和皂苷类［1］。 既往研究发现，金芪降糖片可改善胰岛素抵抗个体的胰岛素敏感性，降低血压和血糖［2］， 还可纠正多囊卵巢综合征患者的肥胖状态，调节糖代谢，调节雄激素的合成，改善多囊卵巢综合征患者的生殖调节轴［3］。 金芪降糖片拆方实验已明确其降血糖作用是以黄连［4］为主， 黄芪、 金银花为辅［5］。 金芪降糖片在生产过程中黄连是直接以原药材细粉入药，为了缩减金芪降糖片的服用剂量从而提高患者用药的顺应性［6］， 本实验在优选黄连生物碱常规提取工艺基础上， 采用纤维素酶辅助提取金芪降糖片中黄连中的生物碱，并通过正交试验筛选出黄连生物碱酶解辅助提取的工艺方法，用以提高黄连中有效成分的浸出率，减少耗能，缩短提取时间，从而达到更有效利用黄连药材资源的目的。

1 材料

美国 Waters高效液相色谱仪； Millennium系统工作站、2484双波长吸 收检测器、 515 双 泵、 Waters恒 温柱温 箱；SZ-93 自动双重纯水蒸馏水器 （上海强运科技有限公司）；BP-211D电子分析天平 （ 德国赛多利斯公司） ； KS-600D超声清洗 机 （ 宁 波 科 生 仪 器 厂 ） ； 黄 连 为 鸡 爪 黄 连 Coptis chinensis Franch.的干燥根 （ 天津中新药业隆顺榕制药厂提供， 由天津医科大学生药教研室周晔教授鉴定）， 符合《中国药典》 2010 年版一部要求； 盐酸药根碱， 盐酸巴马汀，盐酸小檗碱对照品 （中国食品药品检定研究院，批号分别为 110713-200908、 110732-200806、 0733-200905）； 纤维素酶 （天津利华酶制剂技术有限公司， 滤纸酶活力5 109.52 U/g， 批号 为 10-03-19 ） ， 乙腈为 色谱纯， 水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药材中生物碱测定 根据前期工作的方法学考察结果［8］对黄连药材主要生物碱进行了定量测定。 结果见表 1。

表1 黄连中生物碱测定结果

2.2 金芪降糖片生物碱酶辅助提取单因素试验 （n=2）

2.2.1 纤维素酶液的配制 准确称取 500 mg纤维素酶，用 pH4.5 的蒸馏水溶解后定容至 100mL量瓶中， 此酶液质量浓度为 5 mg/mL， 经滤纸酶活力法［9］测定纤维素酶活力为： 5 109.52 U/g。

2.2.2 酶解液 pH值的考察 称取 10 g黄连 9 份， 置于100m L三角瓶中， 加入8 倍量、 以硫酸水分别调成 pH1.4、3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.8， 纤维素酶用量均为药材质量的 0.6%， 于 50 ℃水浴中温热 3.5 h 后， 按初步筛选优化的提取条件， 加入 8 倍量 0.25%硫酸水， 冷浸提取 2 次， 每次 24 h， 收集、 合并提取液， 浓缩定容于100mL量瓶中， 并稀释到刻度。 按照前期工作方法学考察中的色谱条件［8］进样 10 μL。 每个样品平行两份， 经测定，计算生物碱提取率。 小檗碱及总生物碱的提取率见图1。实验结果表明， 在 pH4.0 时， 小檗碱、 总生物碱的提取得率均达到最高。

图1 酶解 PH的考察

2.2.3 酶解时间考察 称取 10 g黄连 9 份， 置于 100 mL三角瓶中， 分别加入 8 倍量 pH4.0 的硫酸水， 纤维素酶用量均为黄连药材质量的 0.6%， 于 50 ℃水浴中分别酶解1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0 h 后， 以下操作同 “2.2.2” 项下。 结果见图 2。 结果表明黄连加入纤维素酶酶解 2.5 h， 小檗碱及总生物碱的提取得率均达到峰值。

图2 酶解时间的考察

2.2.4 纤维素酶用量考察 分别称取10 g黄连8 份， 置于100 mL三角瓶中， 分别加入 8 倍量的 pH4.0 的硫酸水， 加入生 药 质 量 0、 0.3%、 0.6%、 0.9%、 1.2%、 1.5%、1.8%、 2.1%纤维素酶， 于50 ℃水浴中酶解2.5h， 以下操作同 “2.2.2” 项下。 结果见图 3。 结果表明， 当纤维素酶加入量为黄连药材质量的 0.9%时， 小檗碱及总生物碱的提取得率达到最大值。

图3 酶用量的考察

2.2.5 酶解温度考察 称取 10 g黄连 8 份， 分别置于 100 m L三角瓶中， 加入 8 倍量 pH4.0 酸水， 再加入 0.9%纤维素酶， 分别于 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65 ℃的水浴中进行酶解 2.5 h， 以下操作同 “2.2.2” 项下。 结果见图 4。 结果表明， 当酶解温度为 40 ℃时， 小檗碱及总生物碱的提取得率达到最大值。

图4 酶解温度的考察

2.3 正交试验法优选纤维素酶酶解工艺 根据单因素试验考察结果， 采用正交试验设计 L9（34）， 选择纤维素酶用量、 温度、 pH、 酶解时间四个因素作为考察对象， 以小檗碱及总生物碱提取得率为评价指标，评分时将总生物碱提取率和小檗碱提取率的权重系数分别设为 0.4 和0.6， 以综合评分值进行统计分析。 因素水平见表2， 正交试验结果及方差分析结果分别见表3 ～4。

综合评分 =小檗碱提取率 ×0.6+总生物碱提取率 ×0.4

表2 正交试验因素水平

对试验结果做直观分析，由各因素的极差值 R，确定最佳提取工艺，并用方差分析评价各因素水平表对提取工艺影响的显著性， 结果见表4。

根据直观分析结果可知：各因素对提取金芪降糖片总生物碱的影响大小顺序为： C＞D＞B＞A。 直接根据极差值的大小可知： 在考察的四个因素中， 酶解液的pH值影响较大，纤维素酶的用量影响较小， 并且 0.6%和 0.8%的纤维素酶对黄连生物碱的提取率比较接近， 但是选用 0.6%纤维素酶可以降低成本且不影响提取率，因此最佳酶解条件是A1B1C3D3。 根据正交试验结果可得出以纤维素酶辅助提取金芪降糖片生物碱的最佳参数指标分别为：加入相当于药材质量 0.6%的纤维素酶， 在 pH4.5， 35 ℃条件下酶解 3.0 h。正交试验与单因素考察的优选条件是一致的。方差分析表明： 酶解液的pH值、 酶解时间、 酶解温度及纤维素酶用量对金芪降糖片生物碱提取得率的影响无显著性差异。

2.4 验证试验 将药材量放大 10 倍， 即称取 100 g黄连，按照最佳工艺 A1B1C3D3下进行纤维素酶解处理后， 在优选的冷浸条件下进行常规提取。并设置非酶解组与之比较，即不加纤维素酶外，其他提取过程均与酶解辅助提取法提取操作相同。 每个样品平行3份。 实验结果见表5。

表 3 L9（34） 正交试验结果

表4 方差分析

表 5 酶解辅助提取工艺验证结果 （n=3）

上述结果表明， 在 A1B1C3D3工艺条件下黄连生物碱的提取率较高， 小檗碱及总生物碱提取得率分别为 85.27%和87.54%， 与非酶解组相比， 小檗碱及总生物碱提取率分别提高了 29.98%和 30.17%， 浸膏得率降低了 25.19%。

3 讨论

金芪降糖片中的生物碱主要是来源于黄连生物碱，有文献报道金银花中绿原酸可使黄连中小檗碱生成沉淀［10］，所以生产中采用单煎的方式提取黄连生物碱。本实验在单因素和正交试验优选的最佳酶解条件下，对黄连药材总生物碱进行酶解辅助提取，与空白组比较，小檗碱及总生物碱提取率分别提高了约三分之一，其原因是黄连属于根茎类药材，其组织结构致密坚硬不利于有效成分的浸出，通过纤维素酶处理，细胞壁中纤维素被酶水解，减少了药材组织细胞内化学物质溶出的屏障，使其更容易扩散被提取出来。而且通过酶处理后，其浸膏得率降低了约四分之一，也有利于降低成药的剂量。综上，酶辅助提取法不仅提高了金芪降糖片的内在质量，而且还可以缩减服用剂量，提高患者用药的顺应性，并且该方法对设备无特殊要求，应用常规提取仪器即可完成，更有利于在制药工业生产中实施。

黄连中主要含有巴马汀、药根碱、小檗碱等生物碱，其中前二者具有保护缺血心肌、 解毒杀菌［11］等作用， 随着近年来对黄连研究的不断深入，发现小檗碱具有降血糖［12］、 降血压、 降血脂、 抗心律失常、 抗甲状腺癌［13］等功效。也有研究表明小檗碱能通过肝细胞发挥非胰岛素依赖的降血糖作用， 但不能增加胰岛素的分泌［14］。 考虑到小檗碱在治疗糖尿病和心脑血管疾病的作用价值，所以本实验在优选金芪降糖片中生物碱的提取条件时，以小檗碱量为主要考察指标，同时兼顾其他生物碱的量，筛选生物酶解辅助提取金芪降糖片中小檗碱以及总生物碱的工艺，为金芪降糖片的工业化生产提供实验依据。

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R284.2

： B

： 1001-1528（2014）01-0192-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.050

2013-01-12

天津市科技攻关项目 （06YFGPSH02900）

南 楠 （1988—） ， 女， 硕士生， 研究方向： 天然药物化学。 Tel： 13102128508 ， E-mail： nan198829@126.com

*通信作者： 周 晶 （1956—） ， 女， 教授， 研究方向： 中药及中药制剂提取工艺及质量标准化。 Tel： 13920680193， E-mail： zhoujing @tijmu.edu.cn