HPLC-MS联用同时检测支气管类中成药中违禁添加的 11 种糖皮质激素

陈 凤， 陈 宇， 董培健

（1.广西玉林食品药品检验所， 广西 玉林 537000； 2.广西桂林医学院药学本科 2009 级， 广西 桂林541000）

HPLC-MS联用同时检测支气管类中成药中违禁添加的 11 种糖皮质激素

陈 凤1， 陈 宇1， 董培健2

（1.广西玉林食品药品检验所， 广西 玉林 537000； 2.广西桂林医学院药学本科 2009 级， 广西 桂林541000）

目的 建立一个高准确性、 高灵敏度的液相色谱-质谱联用方法， 检测支气管哮喘类中成药中违禁添加的 11 种糖皮质激素 （倍他米松， 丙酸倍氯米松， 氯氟舒松， 醋酸泼尼松龙，氢化可的松， 醋酸氟轻松， 醋酸泼尼松， 醋酸曲安奈德， 醋酸可的松， 氢化泼尼松， 醋酸地塞米松）。 方法 色谱条件为 Waters XTerra® MSC18色谱柱 （2.1 mm× 150 mm， 5 μm）， 柱温 35 ℃， 流动相以 0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈进行梯度洗脱， 体积流量为 0.25 m L/m in。 质谱条件为以电喷雾离子源正离子模式进行质谱数据采集。 结果 在建立的色谱条件下， 11 种糖皮质激素有良好的分离， 且对其定性定量检出， 线性范围良好， 加样回收率为 90% ～110%。 结论 该法操作简便、 快捷、 高灵敏度、高准确性等特点，可同时对中成药中非法添加多种糖皮质激素进行定性定量分离检测。

高效液相色谱-质谱联用； 糖皮质激素； 支气管类中成药

中成药有着服用方便和毒副作用小等特点，但其成分复杂，一般方法不易监督检测，近年来，一些非法厂家为牟取暴利，在中成药中添加糖皮质激素类药物，以提高疗效，误导群众，造成糖皮质激素类药物的滥用。糖皮质激素在一定程度上有着抗炎、抗过敏、抑制免疫反应等作用，但长期使用糖皮质激素时，会诱发和加重感染、引起中枢神经并发症、内分泌及代谢系统紊乱及骨质疏松等，对患者身心健康和生命安全造成极大威胁，其副作用不容忽视［1-2］。 对于糖皮质激素， 目前鉴别方 法主要包括呈色反应、沉淀反应、 薄层色谱［3］、 紫外分光光度法 （UV）、高 效 液 相 色 谱 法 （HPLC）［4-5］、气相质谱联用法 （GC-MS）［6］， 高效液相色谱法-二极管阵列检测法 （ HPLC-DAD）［7］、 液相质谱联用法 （ HPLC-MS）［8-9］， 超高效液相质谱联用法 （ UPLC-MS）［10］等， 对于基质较为复杂的中成药来说，采用 HPLC-MS 的方法更能快速有效地对多种糖皮质激素成分同时分离，并对其定性、定量检测。为了打击此激素类药物的非法滥用，本实验建立了一个简便、快捷、高准确性、高灵敏度的液相色谱-质谱联用方法，同时分离检测支气管类中成药中可能添加的11种糖皮质激素， 加强药物监督工作的建设。

1 仪器和试药

1.1 仪 器 2695/2998/Waters Alliance-Quanttro MicroTM高效液相色谱-质谱联用仪 （ 美国 Waters公司）， KQ-250DB型数控超声波清洗仪 （昆山市超声 仪 器 有 限 公 司）， XS-205DU 电 子 分 析 天 平（METTLER TOLEDO公 司）， 电 子 天 平 及 移 液枪等。

1.2 试 剂 与 试 药 倍 他 米 松 （ Betamethaone，100118-200403）、 丙 酸 倍 氯 米 松 （ Beclonmetasone Dlpropionate， 0119-9802 ） 、 氯 氟 舒 松 （ Halcinonidum， 146-9101）、 醋酸泼尼松龙 （ Prednisolone Acetate， 100124-200303， 纯度为 99.2%）、氢化可的松 （Hydrocortisonum， 152-9204 ）、 醋 酸 氟 轻 松（ Fluocinonide， 100010-200507 ）、 醋 酸 泼 尼 松（ Prednisone Acetate， 0012-9204 ）、 醋 酸 曲 安 奈 德（Triamcinolone Acetonide，0125-9302 ） 、 醋 酸 可 的松 （ Cortisone Acetate，0123-9302 ）、 氢 化 泼 尼 松（ Prednisolonum， 153-9101）、 醋酸地塞米松 （ Dexamethasone Acetate， 100122-200805， 纯 度 为99.6%） 这11 种糖皮质激素药物的对照品均由中国药品生物制品检定所提供；供试品中成药为治疗支气管炎或支气管哮喘类的片剂、丸剂、胶囊及糖浆剂等 （在各药店购得）； 甲醇、 乙腈均为色谱纯，三氯甲烷、甲酸、乙酸铵为分析纯，水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 实验条件

2.1.1 液相色谱条件 Waters XTerra® MS C18色谱柱 （2.1 mm×150 mm， 5 μm）； 柱温 35 ℃； 流动相 A为 0.1%甲酸 10 mmoL/L乙酸铵溶液， 流动相B为乙腈， 梯度洗脱， 洗脱程序见表1； 体积流量 0.25 mL/min； 进样量 10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 M obile Phases gradient elution Program

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源 （ESI）， 电喷雾毛细管 电 压 （ Capillary） 2.71 kV， 源 温 （ source Temp） 120 ℃， 脱溶剂气温度 （ Desolvation Temp）300 ℃， 脱 溶 剂 气 体 积 流 量 （ Desolvation ） 500 L/h， 锥孔气体积流量 （ Cone） 100 L/h， 采用正离子 （ES+） 扫描模式和多反应监测 （MRM） 模式检测。 质谱采集参数见表2。

表 2 11 种糖皮质激素的质谱采集参数Tab.2 MS acquisition Parameter of 11 glucocorticoids

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取上述所要测定的11 种糖皮质激素药物的对照品各约 10 mg于 10 mL量瓶中， 加适量甲醇，超声 （功率 250 W，频率 40 kHz） 10 min， 使其溶解， 并用甲醇定容， 摇匀；再精密量取各对照品溶液，配制成含醋酸泼尼松、 醋酸可的松、 氢化泼尼松各1 000 μg/L， 氯氟舒松、 氢化可的松各 4 000 μg/L， 倍他米松、醋酸泼尼松龙、 醋酸氟轻松、 醋酸曲安奈德各 500μg/L， 醋酸地塞米松 2 000 μg/L， 丙酸倍氯米松250 μg/L的高质量浓度对照品混合溶液； 精密量取该高质量浓度对照品混合溶液3mL，置于10mL量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，摇匀，得较低质量浓度的混合对照品溶液。 过 0.22 μm的滤膜［8］。 在实验条件下精密量取 10 μL进样， 记录图谱。 11种糖皮质激素混合对照品溶液总离子流图（见图1）。

图 1 11 种糖皮质激素混合对照品溶液总离子流图Fig.1 TIC of 11 glucocorticoidsm ixture reference substance

2.2.2 样品溶液 对于片剂、丸剂先将其研细；若为胶囊，则倒出内容物并将其研细，取样品粉末适量 （约相当于该药品一次服用的量），置于 25 mL的量瓶中， 加甲醇 10 mL， 超声 （功率 250 W，频率 40 kHz） 10 min 溶解， 冷至室温， 并用初始流动相 ［0.1%甲酸 10 mmoL/L乙酸铵溶液-乙腈（75 ∶25）］ 稀释至刻度， 摇匀， 过滤， 取续滤液过 0.22 μm的滤膜， 得样品溶液［8］。

若为糖浆剂，取约一次服用量，置于分液漏斗中， 加水 10 mL， 再一次加 10、 10、 5 mL的三氯甲烷-乙腈 （9 ∶1） 分次提取， 合并提取液于另一分液漏斗中， 用水洗涤2 次， 每次15mL。弃掉水层， 将三氯甲烷层蒸干， 残留物用 10 mL甲醇转移至 25 mL量瓶中， 用初始流动相稀释到刻度， 摇匀， 过滤，取续滤液过 0.22 μm的滤膜， 得样品溶液［8］。

2.2.3 标准工作曲线、 线性范围及检出限 分别精密量取 “2.2.1” 项下高质量浓度的 11 种糖皮质激素对照品混合溶液 0.5、 1、 2、 4、 6 mL于 25 m L的量瓶中， 用初始流动相稀释至刻度， 摇匀，配制成一系列质量浓度的对照品混合溶液，分别过0.22 μm的滤膜。 精密量取 10 μL进样，记录图谱。 将峰面积 （A）与其相对应的组分质量浓度（C） 进行线性回归， 所测的 11 种糖皮质激素在实验浓度范围内线性关系良好； 按信噪比 （S/N） 为3 时 计 算 相 应 成 分 的 检 出 限［10-11］。 实 验 结 果 见表3。

2.2.4 加样回收率 精密称取已知含有量的样品9 份， 平均分为 3 组， 分别精密加入 “2.2.1” 项下高质量浓度对照品混合溶液 1、 3 和 5 mL， 照“2.2.2” 项下平行操作处理， 使其成低、 中、 高（分别约 20、 60、 100 μg/L） 质量浓度的加标溶液， 按实验条件进样 10 μL， 记录图谱， 计算 11种糖皮质激素的平均回收率均在 90% ～110%之间。

表 3 11 种糖皮质激素的线性关系及检出限Tab.3 L inear relation and detection lim it of 11 glucocorticoids

2.2.5 精密度试验 精密量取 “2.2.1” 项下较低质量浓度的 11 种糖皮质激素混合对照品溶液 10 μL，按上述实验条件进样， 连续重复 6 次， 记录图谱， 按峰面积计算 RSD， 各成分的 RSD（n=6）分别为： 氢化泼尼松 0.29%、 氢化可的松 0.27%、倍他米松 0.59%、醋酸泼尼松 1.35%、 醋酸可的松0.67%、 醋酸泼尼松龙 0.45%、 醋酸地塞米松0.46%、 氯氟舒松 0.98%、 醋酸曲安奈德 0.45%、醋酸氟轻松 0.82%、丙酸倍氯米松 1.30%。

2.2.6 稳定性试验 精密量取 “2.2.1” 项下较低质量浓度的 11 种糖皮质激素混合对照品溶液 10 μL， 分别在 0、 2、 4、 8、 12、 16、 24 h 按实验条件进样， 记录图谱， 按峰面积计算 RSD均小于5%。 说明 24 h 内 11 种糖皮质激素对照品混合溶液稳定性良好。

2.2.7 所购样品中各激素的测定 在该实验条件下， 共检查了16 批不同的有治疗支气管炎或支气管哮喘的中成药，通过比较样品与对照品中各色谱峰的色谱行为和质谱行为，发现所测的药品中有1批有检出糖皮质激素类药物的现象，检出的药物是：氯氟舒松。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 大部分的糖皮质激素类药物都溶解于三氯甲烷、乙腈、丙酮、甲醇、以及乙酸乙酯中［12］。 本实验刚开始所采用的流动相为甲醇-0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸铵溶液， 反复调节该流动相组分比例， 实验中的11种糖皮质激素仍未得到良好的的色谱行为。最后将流动相更换乙腈-0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸铵溶液， 经过反复的摸索和调节之后， 发现按表 1进行梯度洗脱， 11种糖皮质激素能得到良好的分离，并有良好的色谱行为和质谱行为， 可以将实验中的 11 种糖皮质激素进行定性定量分析。 文献［13］报道当甲酸含有量为 0.05% ～0.1%时， 随着甲酸含有量的增加， 大多数糖皮质激素的响应值均逐渐增加；而甲酸含有量为 0.1% ～0.3% 时， 随着甲酸含有量的增加，响应值又逐渐降低； 所以甲酸含有量为 0.1%时目标化合物的响应值最高。乙酸铵使流动相保持一定的离子强度，改善峰型，减少拖尾。因此，最终选用了乙腈-0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸铵溶液作为该实验的流动相，按表1的洗脱程序进行梯度洗脱。

3.2 样品的前处理与净化 本实验比较了 3 种不同的样品前处理净化方法。平行称取6份样品于25 mL量瓶中， 均分为 3 组， 分别加入 10 mL甲醇和 3 mL的高质量浓度混合对照品溶液， 超声 10 min 后，冷却。 第 1 份溶液直接用流动相稀释至刻度［14］； 第 2 份溶液过 HLB固相萃取柱［15］， 并用流动相洗脱到25 mL的量瓶中， 流动相稀释至刻度；第 3 份溶液过 C18固相萃取柱， 并用流动相洗脱到25 mL的量瓶中， 流动相稀释至刻度［16］。 按实验条件各进样 10 μL。 结果发现， 按第 1 份加样回收的样品溶液处理完后不选择过柱，直接定容时，回收率较高。

4 结论

本实验样品前处理方法简单、成本低、污染小， 采用 0.1%甲酸 10mmol/L乙酸铵溶液-乙腈的流动相进行梯度洗脱， 并对其进行 ES+正离子扫描和 MRM模式检测， 本实验建立了一个简便、 快捷、 高准确性、 高灵敏度的 HPLC-MS 的方法， 能快速有效地对中成药中非法添加的11种糖皮质激素类药物同时定性、定量检测。本研究为支气管类中成药中非法添加糖皮质激素类药物提供了一个有实用价值的检测方法，以便加强中成药类非法添加的监督管理工作。

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Simultaneous determ ination of eleven glucocorticoids in Chinese trandition medicines for bronchus by HPLC-MS

CHEN Feng1， CHEN Yu1， DONG Pei-jian2
（1.Guangxi Yulin Institute for Food and Drug Control， Yulin 537000， China； 2.Guangxi Guilin Medical College， Guilin 541000， China）

AIM To establish amethod for detecting eleven glucocorticoids（Betamethaone， Beclonmetasone，Dlpropionate， Halcinonidum，Prednisolone acetate， Hydrocortisonum， Fluocinonide，Prednisone acetate，Triamcinolone acetonide， Cortisone acetate， Prednisolonum， Dexamethasone acetate） thatwere illegally added in antiasthmatic herbal preparations.M ETHODS Waters XTerra® MSC18（2.1 mm×150 mm， 5 μm） column was used with column temperature of35 ℃， themobile phase was consisted of 0.1%formic acid-10 mmol/L ammonium acetate solution and acetonitrile in gradientelutionmanner， the flow rate was 0.25 mL/min.Electronspray ionization in the positive ionsmode was adopted in mass spectrometry.RESULTS In the chromatographic conditions established， the eleven glucocorticoidswere separated finely and could be detected qualitatively and quantitatively，the range of linearity was good with the labeled recovery from 90%to 110%.CONCLUSION Thismethod not only is convenient， rapid， sensitive and accurate， butalso can be used to separate and detecta variety ofglucocorticoids qualitatively and quantitatively in Chinese trandition medicines at the same time.

HPLC-MS； glucocorticoids； Chinese trandition medicines for bronchus

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0102-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.025

2013-03-04

陈 凤 （1978—） ， 女， 硕士生。 E-mail： feng077101@163.com