金黄膏中小檗碱体外透皮吸收研究

刘俊红， 王 红， 曲鹏飞， 李棣华， 郭 林， 吕沅珊

（1.天津市中西医结合急腹症研究所， 天津 300100； 2.天津市中医药大学第二附属医院， 天津 300150）

金黄膏中小檗碱体外透皮吸收研究

刘俊红1， 王 红2*， 曲鹏飞2， 李棣华1， 郭 林2， 吕沅珊1

（1.天津市中西医结合急腹症研究所， 天津 300100； 2.天津市中医药大学第二附属医院， 天津 300150）

目的 筛选金黄膏中小檗碱体外透皮吸收试验的接受液并建立分析方法，探讨金黄膏中其他药味对小檗碱透皮效果的影响，进一步探讨其透皮系统。方法 采用体外经皮渗透法，使用透皮扩散试验仪，选择大鼠腹部皮肤为渗透屏障， 以不同溶媒系统作为接受液， 用 HPLC测定接受液中小檗碱的量。 考察全方及某些药味缺方中小檗碱的透皮特性。 结果 选用 30%乙醇/磷酸盐缓冲溶液 （pH 6.8） 为接受液， 建立金黄膏透皮吸收试验中小檗碱的测定方法。 无论全方还是缺味方， 小檗碱透过率都较低。 缺味方 （Ⅴ） 和 （Ⅵ） 的稳态透皮速率、 透皮时滞及32 h 内小檗碱单位面积累积透过量都较全方高。 有天南星、 陈皮、 厚朴的缺味方 （Ⅴ） 的透皮时滞低于缺味方 （Ⅵ）。 结论 金黄膏中的小檗碱经皮渗透缓慢，同时受复方中其他药味的影响，其中天南星、陈皮、厚朴起一定的促进作用，姜黄、白芷起一定的抑制作用。

金黄膏；小檗碱；高效液相色谱法；透皮吸收；透皮系统

如意金黄散出自明代陈实功［1］编著的 《 外科正宗》，由大黄、 黄柏、姜黄、白芷、 天花粉、 天南星等组成， 为 2010 年版 《中国药典》 （一部）收录的品种，具有活血散瘀、消肿止痛之功效，临床用于治疗疮疡肿痛、丹毒流注、跌打损伤等证［2］。 金黄膏是由如意金黄散经改变剂型而制备的外用膏剂，作为医院制剂应用于临床多年，疗效确切。方中大黄、黄柏具有清热解毒燥湿的作用，为君药，本实验以黄柏中小檗碱为指标成分，进行了盐酸小檗碱透皮吸收的方法学研究，考察了全方及缺味方膏剂中盐酸小檗碱的体外经皮渗透行为，并探讨其它药味对其透皮效果的影响。

1 材料

TK-12B型透皮扩散试验仪 （上海锴凯科技贸易有限公司）， SSIPC2000 型高效液相色谱仪 （美国科学系统公司），EZChrom Elite Client/Server色谱工作站， AL104 电子天平 （梅特勒-托利多仪器有限公司）。 盐酸小檗碱对照品 （中国药品生物制品检 定 所， 批 号 110713—200911， 供 含 量 测 定用），金黄膏及缺味膏剂 （天津市中医药大学第二附属医院制剂室提供）。 甲醇、 乙腈为色谱纯 （天津市康科德科技有限公司）， 磷酸、 磷酸二氢钠、磷酸 氢 二 钠 为 分 析 纯。 雄性 wistar大 鼠 （200 ～250 g） （由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，合格证SCXK-（军） 2009-003）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Apollo C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相 A相为乙腈， B相为 0.1%磷酸水， 采用二元梯度洗脱程序 （见表 1），体积流量 1.0 m L/min， 进 样 量 为 20 μL， 检测 波 长 346 nm， 柱温 30 ℃。 该色谱条件下， 理论板数按盐酸小檗碱峰计算不低于150 000。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradien t elu tion mode

2.2 对照品溶液的制备 精密称定盐酸小檗碱，加入量瓶， 用乙腈配制成质量浓度为 0.290 mg/mL的溶液，作为贮备液。

2.3 筛选接收液最大溶解度［3］前期已经做过盐酸小檗碱的线性考察及系统适应性试验，在此不赘述。将盐酸小檗碱对照品贮备液2 m L置锥形瓶中减压浓缩至干，加入不同的接收液1 mL超声处理使其充分溶解，配制成过饱和溶液，稀释一定倍数， 经0.45 μm微孔滤膜滤过， 进样测定， 计算结果见表 2。 确定选用接受液 30%乙醇/生理盐水（Ⅰ）、 30%乙醇/水 （Ⅱ）、 30%乙醇/磷酸盐缓冲溶液 （pH=6.8） （Ⅲ），再分别对其做体外透皮试验，选择适宜的接受液。

表 2 盐酸小檗碱在不同接收液中的最大溶解度 （mg/m L， n=3）Tab.2 Maxima solubility of berberine hydrochloride in different accePted solutions（ mg/m L， n=3）

2.4 供试膏剂中药组成及供试液的制备 全方（Ⅳ） 组成为大黄、 黄柏、 姜黄、 白芷、 天花粉、天南星、陈皮、甘草、苍术、厚朴；缺味方 （Ⅴ）为大黄、黄柏、天花粉、天南星、陈皮、甘草、苍术、厚朴；缺味方 （Ⅵ） 为大黄、黄柏、天花粉、甘草、苍术。3组分别制成供试膏剂。由体外透皮试验所得接受液， 加入梨形蒸馏瓶， 分别于70℃水浴减压浓缩至干，精密吸取 1 mL乙腈溶解，0.45 μm微孔滤膜， 作为供试液。

2.5 标准曲线的绘制 精密吸取一定量盐酸小檗碱对照品贮备液加入梨形蒸馏瓶，分别加入不同接受液 （Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ） 8 mL， 按 “2.4” 项下配制供试液，再分别吸取不同体积溶液注入色谱仪，按照上述色谱条件测定。以各体积溶液对照品峰面积积分值 （Y， mAu） 对进样量 （X， ng） 进行线性回归，各接受液的标准曲线方程见表3。结果显示，不同接受液中，盐酸小檗碱线性良好。

表3 3种接受液的回归方程Tab.3 Regression equations of three kinds of accePted solu tions

2.6 透皮吸收试验

2.6.1 鼠皮的制备 取健康雄性大鼠， 将大鼠麻醉后固定四肢，剪去腹部正中线两侧的鼠毛，再用电动剃须刀剃净绒毛后迅速剥皮，小心剔除皮下脂肪及组织，用滤纸擦拭干净，得离体鼠皮，放入冰箱 （ -20 ℃） 冷冻保存。

2.6.2 渗透扩散装置及试验方法 将鼠皮从冰箱取出，放至室温，在接收池中放入磁力搅拌子，将鼠皮固定于扩散池与接收池之间，真皮面向接收池。试验时，将精密称量的膏剂涂于处理好的鼠皮角质层，注满接收液，液面恰与皮肤真皮层接触，排除气泡。开动磁力搅拌器和恒温水浴，磁力搅拌转速设定为 400 r/min， 水浴温度 （ 37 ±0.5） ℃， 扩散池容积6 mL， 扩散面积为 2.92 cm2。 于32 h 内分段取样，补充相应的空白接受液， 按 “2.4” 项下方法配制供试液，根据浓度吸取不同体积溶液注入色谱仪，按照上述色谱条件测定小檗碱量，统计数据。

2.6.3 不同接受液对小檗碱体外经皮渗透行为的影响 分别以 30%乙醇/生理盐水 （Ⅰ）、 30%乙醇/水 （ Ⅱ ）、 30% 乙 醇/磷 酸 盐 缓 冲 溶 液（pH6.8） （Ⅲ） 为接受液， 按 “2.6.2” 项下方法试验，统计得到不同接受液不同时间段小檗碱的单位面积平均累积透过量 Q。以时间 t为横坐标， Q为纵坐标， 绘制经皮渗透曲线， 见图1。 计算不同接受液的透皮速率常数 J（μg·cm-2·h-1） 和透皮时滞 （h）， 经皮渗透曲线及参数见表 4。 结果30%乙醇/磷酸盐缓冲溶液 （pH6.8） 的透皮速率常数 J最大， 32 h 单位面积累积透过量 Q最多，透皮时滞 Tlag最短， 因此确定选做透皮实验 的接受液，进行下一步方法学考察。

表 4 不同接受液中小檗碱经皮渗透曲线及参数 （n=3）Tab.4 Percutaneous Permeation curve and Parameters of berberine in different accePted solutions（ n=3）

图 1 3 种接受液经皮渗透-时间曲线Fig.1 Transdermal delivery-tim e cu rve of three kinds of accePted solutions

2.6.4 精密度考察 取 “2.5” 项下制备的含有对照品的 30%乙醇/磷酸盐缓冲溶液 （ pH6.8），按高、中、低3种质量浓度分别连续进样测定5次，将所得峰面积进行统计，得到相对标准偏差（RSD） 分别为 1.46%、 1.86%、 2.47%。 表明精密度符合要求。

2.6.5 稳定性考察 将 “2.5” 项下制备的含有对照品的 30%乙醇/磷酸盐缓冲溶液 （ pH6.8），在48 h内不同的时间间隔进样测定， 将所得峰面积进行统计， RSD为 1.21%，表明盐酸小檗碱溶液在48 h内稳定。

2.6.6 加样回收率试验 按金黄膏处方， 除去黄柏，其它药味用基质制备阴性对照药膏。按“2.6.2” 项操作， 间隔取样， 将接受液混合， 作为空白接受液备用。 将对照品贮备液10 μL加入空白接受液6份，同前方法制备样品，进样测定，结果平均回收率为 98.5%， RSD为 1.65%。

2.6.7 全方及缺味方膏剂中盐酸小檗碱的体外经皮渗透行为 将全方 （Ⅳ） 及缺味方 （Ⅴ）、（Ⅵ） 药膏分别作透皮吸收试验， 所加药膏量根据盐酸小檗碱量确定，确保其基本一致。按“2.6.2” 项下方法试验，按下式计算不同膏剂不同时间段盐酸小檗碱的单位面积平均累积透过量Q及32 h 内小檗碱累积透过百分率 Q%。

式中 Q为 t时刻的累积透过量 （μg/cm2）； （Mn为第 n个取样点测得的药物透过量 （μg）； ∑Mp为之 前 测 得 的 药 物 透 过 量 之 和 （μg）； A（2.92cm2） 为皮肤扩散面积。 以时间 t为横坐标，累积渗透量Q为纵坐标，绘制经皮渗透曲线。以Q对 t进行回归得线性方程，根据方程可以求出稳态透皮速率 J（ μg· cm-2· h-1） 和透 皮 时 滞 Tlag（h）， 结果见表 5、 图 2。

3 结论及讨论

3.1 选择适合的透皮吸收接受液是开展药物的体外经皮渗透试验的重要基础。接受液应具有接受通过皮肤药物的能力，首先要考虑药物在其中的溶解度，还要考虑皮肤内外环境的特殊性。盐酸小檗碱在水中溶解度小，使用低浓度乙醇既可以改善其溶解性，同时可使角质层膨胀疏松，增加皮肤的通透性［4］，还可以起到防腐的作用。盐酸小檗碱在 pH6～pH8 的磷酸盐缓冲液中的溶解度变化较小， 比水的溶解度高［5］， 因此再加上磷酸盐缓冲溶液控制酸碱度。 根据结果， 最终选择 30%乙醇-磷酸盐缓冲溶液即可。

表 5 经皮渗透线性方程及参数 （n=3）Tab.5 Percutaneous Permeation regression equations and Parameters of berberine in three kinds of cream （n=3）

图 2 3 种膏剂的经皮渗透-时间曲线Fig.2 Transdermal delivery-time curve of three kinds of cream

3.2 从 3 种膏剂的回归方程及经皮渗透-时间曲线可以看出，盐酸小檗碱呈一匀速释放过程，其动力学特征符合 Fick 扩散规律。

3.3 在做透皮试验之前， 已经测定全方及缺味方中盐酸小檗碱的量，以保证透皮试验所加药物中小檗碱含有量基本一致。从结果来看，无论全方还是缺味方，小檗碱透过率都很低。药物的透皮吸收过程分为3个阶段：药物从基质中释放、药物穿透角质层屏障、 药物通过表皮和真皮被血管吸收［6］。 原因分析有以下几点： （1） 从第一阶段 “药物从基质中释放”分析，由于金黄膏是复方制剂，全方药味达10味， 而且由于外用制剂载药量的限制，所以每单味药的量相对较少，皮肤内外不能形成较大的浓度差，向体内的渗透速率会缓慢；由于直接用药材粉末，而非提取物或药物成分，活性成分需要先经过从细胞中扩散到皮肤表面的过程，延缓了扩散速度；另外，金黄膏基质主要为脂溶性的蜂蜡，对小檗碱的释放和经皮扩散有一定限速影响；（2） 从后两个阶段分析， 小檗碱为季铵型生物碱，脂溶性差，而小檗碱在自然界多以季铵盐的形式存在，水溶解度也偏低，溶解度成为其吸收过程的限速因素，通过角质层脂质双分子层的渗透能力受到限制；也有可能与皮肤蛋白质或脂质等形成可逆性结合，结合作用延长药物透过的时间。而全方的稳态透皮速率及透皮时滞都低于缺味方，说明全方较快达到稳态之后缓慢渗透。 缺味方 （Ⅴ） 和 （Ⅵ）的稳态透皮速率及32 h内盐酸小檗碱累积透过量差别不大，有天南星、陈皮、厚朴的缺味方 （Ⅴ）透皮时滞低于缺味方 （Ⅵ）， 说明初始天南星、 陈皮、厚朴对小檗碱的皮肤渗透有一定促进作用，随后会受到姜黄、白芷的抑制作用。

3.4 现 在多 有 制 成 乳 膏 剂［7］、 巴 布 剂［8-9］、 贴 膏剂［10-11］等，基质 不 同， 透 皮 效 果 也 各 有 差 异， 但只要与临床适应症相适宜就可。 王红［12］曾对如意金黄散 （膏） 中药味之间的关系， 从中药药性及中医药理论方面分析，对起透皮作用的药物是哪几味药提出过自己的假设， 认为 （1） 金黄膏可能取配伍中苦寒之用佐以辛温之药达到温散走窜的促渗作用， 亦或天南星。 （2） 合理的配伍， 既能达到治病作用又能渗透入内，从局部影响全身的作用呢？即整体就是其透皮系统。本实验即是从通过体外透皮试验方面加以验证探讨。一般的透皮给药系统，是指药物以一定的速率透过皮肤，经毛细血管吸收进入全身血液循环达到有效浓度，产生疗效，起到全身治疗作用。还有一种情况，有些药物与角质层亲和力大或能与角质层发生特异结合，在皮肤内积聚储存， 形成 “储库效应”， 慢慢向皮肤深部扩散。其主要起到局部的药理作用，而减弱了全身的治疗作用。金黄膏作为医院制剂应用于临床多年，疗效确切。如果小檗碱也有这样的可能性，大部分滞留在皮肤，达到抑菌消炎的作用，一部分透过皮肤起到全身治疗作用，正好与金黄膏的适应症相吻合。金黄膏药味较多，而每味药的化学成分种类繁多，既有水溶性成分又有脂溶性成分，性质各异，它组成一个整体的透皮系统，每种药味、每种成分都各负其责，又相互影响，相互协同，符合传统医学的整体观念。

［ 1 ］ 陈实功.外科正宗［M］.北京： 人民卫生出版社， 1964.

［ 2 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典： 2010 年版一部［S］.北京： 中国医药科技出版社， 2010： 720.

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M ethodology of Percutaneous absorPtion in vitro of berberine and effects of other herbs from Jinhuang Cream

LIU Jun-hong1， WANG Hong2*， QU Peng-fei2， LIDi-hua1， GUO Lin2， LÜYuan-shan1
（1.Tianjin Institute of Acute Abdomen in Integrated TraditionalChineseandWestern Medicine， Tianjin 300100， China； 2.The Second Hospital Affiliated to Tianjin University of Traditional ChineseMedicin， Tianjin 300150， China）

Jinhuang Cream； berberine；HPLC； percutaneous absorption； transdermal system

R940

： A

： 1001-1528（2014）01-0065-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.016

2013-03-16

国家自然基金资助项目 （81072818）

刘俊红 （1968—） ， 女， 副研究员， 从事中药药学研究。 Tel： （022） 27435360 E-mail： nlnbq@sina.cn

*通信作者： 王 红， 男， 主任医师。 Tel： （022） 60335404， E-mail： ctwanghong@sina.com