痹祺胶囊提取物对 RAW 264.7 细胞模型的抗炎作用

张馨方， 王强松， 崔元璐*

（1.天津中医药大学中医药研究院， 天津 300193； 2.天津生物工程职业技术学院， 天津 300462）

痹祺胶囊提取物对 RAW 264.7 细胞模型的抗炎作用

张馨方1，2， 王强松1， 崔元璐1*

（1.天津中医药大学中医药研究院， 天津 300193； 2.天津生物工程职业技术学院， 天津 300462）

目的 通过比较研究痹祺胶囊 （马钱子、党参、丹参、 白术、 茯苓、 川芎、三七、地龙、 甘草、 牛膝） 不同溶剂提取物的抗炎作用，从而确定最佳提取溶剂。方法 3种溶剂提取痹祺胶囊，水、石油醚、正丁醇的提取物与脂多糖 （LPS） 刺激小鼠单核 /巨噬细胞 RAW264.7 共孵， 用酶联免疫吸附法 （ELISA）、 Griess Reagent法检测细胞分泌的肿瘤坏死因子 （ TNF-α） 和一氧化氮 （ NO） 的水平； 以实时定 量逆转录-聚合 酶链式 反应 （ Real-time RT-PCR） 检测细胞炎症相关指标白介素-6 （ IL-6）、 环氧合酶-2 （ COX-2 ） 、 诱导型一氧化氮合酶 （ iNOS） 、 TNF-α的 mRNA表 达水平， 比较 3 种提取物的抗炎作用。 结果 3 种提取物均能显著抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞分泌 NO和 TNF-α， 其中水提取物的抑制作用最强， 且剂量依赖性最显著。 在基因表达水平， 只有水提取物对 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞的IL-6、 COX-2、 iNOS 的 mRNA表达有显著抑制作用。 结论 体外细胞药理学实验结果表明， 痹祺胶囊内容物以水、 石油醚、正丁醇3种溶剂体系提取得到提取物均具有抗炎作用，但水提取物抗炎作用更显著。

痹祺胶囊；提取工艺；巨噬细胞；脂多糖；抗炎

痹祺胶囊由马钱子、党参、丹参、白术、茯苓、川芎、三七、地龙、甘草、牛膝十味中药组成，功能益气养血、祛风除湿、活血止痛，用于气血不足，风湿阻滞，肌肉关节酸痛，关节僵硬变形等。近年来药理研究表明痹祺胶囊具有抗炎、消肿、 镇痛及改善动脉血流等作用［1］。 痹祺胶囊主要用于中医 “痹症” 范畴疾病的治疗， 经过多年临床应用，其疗效得到了广泛的认可。但痹祺胶囊是由中药饮片粉碎得到的生药粉直接灌装胶囊制成，患者服用量偏大。未来考虑对药材进行提取，得到提取物灌装胶囊，以减少患者的服用量。但如何设计合理的提取工艺以确保其疗效，是制剂工艺改进面临的一个首要问题。本研究分别设计以水、石油醚、正丁醇作为溶剂提取痹祺胶囊内容物药粉，选择水作为提取溶剂，主要考虑传统中药以水煎煮法获得复方的有效成分，操作简便，提取效率高，是中药提取的传统方法；石油醚极性较小，可以用于油脂性成分的抽提；正丁醇对极性较大的成分提取效果好。选择这3种溶剂提取痹祺胶囊复方多种成分的代表性好。另外，随着中药用药安全性要求的逐渐提高，明确中成药的有效部位和治疗作用的分子药理学机制，也是亟待解决的问题。因此，有必要对痹祺胶囊不同溶剂体系提取的提取物，进行药理活性比较研究，以期获得最优提取工艺。 本实验采用脂多糖 （LPS） （1 mg/L） 刺激RAW264.7 细胞构建的体外细胞炎症模型， 比较研究痹祺胶囊不同提取工艺制备的提取物体外抗炎作用的差别，从而对痹祺胶囊未来制剂工艺改进的二次开发研究，提供数据支持。

1 实验材料

1.1 试验药物 痹祺胶囊提取物的制备： 痹祺胶囊原药粉末，由天津京万红药业股份有限公司提供（批号为 301510）， 精确称取 3 等份， 各 10 g， 分别以 150 mL蒸馏水、 正丁醇和石油醚 3 种溶剂室温下超声提取 30 min， 如此重复提取 3 次，合并 3次的提取物，过滤、回流浓缩、冷冻干燥即得。水、正丁醇、石油醚3种溶剂提取物的得率分别为25.9%、12.7%、 4.1%。 使用时精确称取相应质量，以细胞培养基溶解痹祺胶囊水提取物配制成合适浓度， 石油醚和正丁醇提取物由 DMSO溶解，再用培养基稀释， DMSO终质量分数不超过0.1%，空白对照组也加入相同剂量的 DMSO溶液。0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，现配现用。

1.2 细胞株 小鼠单核/巨噬细胞株 RAW 264.7购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库。RAW264.7 细胞以含有 10% 热灭活胎牛血清 （HIFBS） 的 DMEM高糖培养基培养， 添加 100 U/mL的青霉素和 100 μg/m L的链霉素， 培养于 37 ℃、5%CO2、 饱和湿度的培养箱内。 细胞隔天换液，融合80%或以上时以无菌细胞刮刀刮下， 无菌一次性移液管吹打细胞呈单细胞悬液，接种于多孔培养板或传代继续培养。

1.3 试 剂 与 仪 器 脂 多 糖 （ 美 国， Sigmaaldrich）， TNF-αELISA试剂盒 （ 美国 Invitrogen），UNIQ-10 柱式总 RNA提取试剂盒 （ 中国上海， 生工）， ImProm-Ⅱ逆转录试剂盒 （美国， Promega），SYBR Green 法 Real-time PCR试剂盒 （ 美国， Sigma-aldrich）。 CO2培养箱 （ 美 国， Thermo）， 多功能读板机 （瑞士， TECAN）， 倒置相差显微镜 （日本， Nikon ）、 核 酸 蛋 白 分 析 仪-DU800 （ 美 国，Beckman Coulter）， 高速离心机-22R （ 美国， Beckman Coulter） ， 7500 型全自动荧光定量 PCR仪 （美国， ABI）。

2 实验方法

2.1 分组与给药 设空白对照组， LPS 刺激模型组，痹祺胶囊水提取物组，痹祺胶囊石油醚提取物组，痹祺胶囊正丁醇提取物组。空白组只加入含5%HI-FBS 的无酚红培养基； LPS 模型组加入含有1 mg/L脂多糖的 5%HI-FBS 无酚红培基； 3 种提取物组在 LPS 模型组所用培养基中再加入不同质量浓度的3种溶剂提取物，细胞增殖实验结果显示，提取物终质量浓度小于 2 mg/L对细胞增殖无影响［2］（数据未列出）， 故在一氧化氮 （ NO） 和肿瘤坏死因子 （TNF-α） 的检测实验中均设置 3 个质量浓度，提取物终质量浓度分别为 0.25、 0.5、1 mg/L， 在 PCR 实 验 中 只 设 置 终 质 量 浓 度为1 mg/L。

2.2 对 LPS 刺激 RAW264.7 细胞分泌 NO、 TNF-α的影响 RAW264.7 细胞接种于 96 孔板中， 待细胞全部贴壁后， 各组按 “2.1” 项描述换入相应的培养基。 继续培养 24 h， 取细胞培养上清液检测RAW264.7 细胞分泌 NO［3］和 TNF-α的水平。

2.3 对 LPS 刺激 RAW264.7 细胞相关细胞因子mRNA表达的影响 RAW264.7 细胞接种于 6 孔板中，待细胞全部贴壁后，各组按 “分组与给药”部分描述换入相应的培养基。 继续培养 6 h， 以UNIQ-10 柱法提取细胞总 mRNA，按 ImProm-Ⅱ逆转录试剂盒操作， 将其逆转录为 cDNA， 得到的cDNA样品开展 Real-time PCR［4］， 检测白细胞介素-6 （IL-6） 、 环氧合酶-2 （ COX-2）、 诱导型一氧化氮合酶 （iNOS）、肿瘤坏死因子 （TNF-α） 的 mRNA表达水平， 引物序列见表1。

3 统计分析

实验数据以平均值 ±标准偏差表示， 使用 Origin Pro 7.5 软件进行数据统计分析并做图。 组间比较使用单因素方差分析 （One-Way ANOVA），以P＜0.05 或 P＜0.01 为具有统计学意义。

表 1 Real-time RT-PCR引物序列Tab.1 Real tim e RT-PCR oligo-nucleotide Primers

4 结果

4.1 痹祺胶囊提取物抑制 LPS 刺激的 RAW264.7细胞分 泌 NO 运用 Griess试剂法 检 测 LPS 刺 激RAW264.7 细胞培养液中的 NO水平， 3 种不同溶剂提取物均能抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞分泌 NO （P＜0.01）。 其中， 水提物抑制作用最强，且剂量依赖性显著；相比之下，石油醚和正丁醇的提取物抑制细胞分泌NO作用较弱，且提取物各质量浓度的抑制作用无显著性剂量依赖关系，结果见图1。

图1 痹祺胶囊水、 石油醚、 正丁醇提取物对 LPS刺激 RAW 264.7 细胞产生一氧化氮的影响 （n=6）Fig.1 Effects of Biqi CaPsules from water， Petroleum ether and n-butanol on the exPression of NO mediator in LPS-stimulated RAW 264.7 （n=6）

4.2 痹祺胶囊提取物抑制 LPS 刺激的 RAW264.7细胞分泌 TNF-α 以 ELISA法检测不同溶剂提取物对 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞上清液中 TNF-α水平的影响，结果表明 （ 见图 2）， 3 种痹祺胶囊提取物均能显著抑制 LPS 刺激 RAW264.7 细胞产生TNF-α（P＜ 0.01）， 且均能表现出剂量依赖性，其中尤以痹祺胶囊水提物高剂量组 （1 mg/L） 抑制作用最显著。

图2 痹祺胶囊水、 石油醚、 正丁醇提取物对 LPS刺激 RAW 264.7 细胞分泌 TNF-α的影响 （n=6）Fig.2 Effects of Biqi CaPsules from water， Petroleum ether and n-butanol on the exPression of TNF-α mediator in LPS-stimulated RAW 264.7（n=6）

4.3 痹祺胶囊提取物对 LPS 刺激 RAW264.7 细胞炎症相关 指 标 mRNA表达的影响 LPS 刺 激RAW264.7 细胞能使细胞内相关炎症因子的 mRNA表达水平显著升高， 3 种提取物对 IL-6、COX-2 和iNOSmRNA的表达均有一定的抑制作用 （ 见图3）， 但仅痹祺胶囊水提取物与模型组比较具有显著性差异 （P＜0.05 或 P＜0.01）； 3 种痹祺胶囊提取物对 TNF-α基因表达的抑制作用不明显。

图 3 痹祺胶囊水、 石油醚、 正丁醇提取物对 LPS刺激 RAW 264.7 细胞内 IL-6 （ A） 、 COX-2 （ B） 、 iNOS（ C） 、 TNF-α（D） mRNA表达的影响 （n=6）Fig.3 Effects of Biqi CaPsules from water， Petroleum ether and n-butanol on themRNA exPression of IL-6 （ A） ， COX-2 （ B） ， iNOS（ C） ， TNF-α（ D） in LPS-stimulated RAW 264.7 （ n=6）

5 讨论

痹祺胶囊是治疗 “痹症” 的要药， 在治疗风湿、类风湿性关节炎、骨关节炎等疾病方面已经取得了很好的临床疗效，大量临床观察与动物药理实验表明痹祺胶囊具有止痛快、抗炎作用强、毒副作用小的优势［5］， 本实验主要针对痹祺胶囊 3 种不同溶剂提取物的体外抗炎作用进行了研究。

以 LPS 刺激小鼠单核/巨噬细胞株 RAW264.7，可以诱导细胞产生多种炎症相关介质和细胞因子［2］，例如分泌 NO，TNF-α，IL-6， COX-2 等。 以 LPS 刺激 RAW264.7 细胞作为体外炎症模型［6-8］， 被广泛用于抗炎药物的筛选评价。其中NO作为众多炎症介质中的重要因子之一，在调节多种生理功能方面起重要作用，例如血管扩张、神经传递和炎症应答等［9-10］。 RAW264.7 细胞株经 LPS 刺激向细 胞 培 养液中释放产生的NO， 其浓度可以用来评价炎症反应的强弱程度［11］。 痹祺胶囊 3 种溶剂提取物均有很强的抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞分泌 NO的作用，但是尤其以水提取物抑制作用最强，且剂量依赖性明显，显示出水提取工艺对痹祺胶囊中抗炎有效成分的提取效率最高。

TNF-α和 IL能诱导关节细胞 （ 软骨细胞和滑膜细胞等）产生其它细胞因子、蛋白酶类、集落刺激因子和前列腺素等，在关节炎症的引起、发生、 发展和治疗过程中都有极 其重要 的作用［12］。TNF-α是其中最具有代表性的炎症因子， 它参与和调控多条炎症相关通路的开放与运行［13］。 检测不同溶剂的痹祺胶囊提取物对 LPS 刺激的 RAW264.7细胞上清液中 TNF-α水平的影响， 能间接反映其抗炎作用的强弱。结果显示，痹祺胶囊3种溶剂的提取物均可以抑制 RAW264.7 细胞分泌 TNF-α， 同时也显示出抑制炎症因子的基因表达，其中尤其以水提物的抑制作用最强，与正丁醇和石油醚提取物相比具有显著优势，这也表明水提取工艺对痹祺胶囊中抗炎有效成分的提取效率最高，或者说痹祺胶囊中起抗炎作用的有效成分以水溶性成分为主。

以往对痹祺胶囊的研究主要在药理和临床疗效观察方面，几乎没有制备工艺相关的报道。而对痹祺胶囊中各中药成分的提取工艺研究则大都只采用化学成分作为考察指标，缺乏提取物药效学指标的考察和验证。本实验以水、石油醚和正丁醇3种具有代表性的溶剂提取痹祺胶囊有效成分， 以 LPS刺激 RAW264.7 细胞为炎症模型， 检测 3 种提取物给药后对炎症相关介质 NO、 TNF-α等的分泌与mRNA的表达情况， 初步筛选出水较其他两种溶剂更适合作为痹祺胶囊的提取溶剂。这为今后痹祺胶囊制剂工艺改进的二次开发研究，提供数据支持。

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Anti-inflammatory effect of three extractions from Biqi CaPsules on LPS-stimulated RAW 264.7 macroPhages

ZHANG Xin-fang1，2， WANG Qiang-song1， CUIYuan-lu1*
（1.Institute of Traditional ChineseMedicine， Tianjin University of Traditional ChineseMedicine， Tianjin 300193， China； 2.Tianjin Vocational Collegeof Beioengineering， Tianjin 300462， China）

AIM To determine the best extraction of Biqi Capsules（ Strychni Semen，Codonopsis Radix，Salviaemiltiorrhizae Radix et Rhizome， Atractylodismacrocephalae Rhizoma， Poria， Chuanxiong Rhizoma， Notoginseng Radix et Rrhizoma， Pheretima， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Achyranthis bidentatae Radix） by different solvents， and to compare their anti-inflammatory effects.METHOD The anti-inflammatory action of aqueous，petroleum ether and n-butanol extracts to lipopolysaccharide（LPS） -stimulated mouse mononuclear macrophage cells line RAW 264.7 were compared in vitro.Production of nitric oxide（ NO） and tumor necrosis factor-alpha（ TNF-α） weremeasured by the Griess colorimetric method and Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay（ ELISA） ，respectively.ThemRNA expression levels of inducible nitric oxide synthase（iNOS）， cyclooxygenase（COX-2），TNF-α， and interleukin-6 （ IL-6） were detected by quantitative real-time RT-PCR.RESULTS Three extracts of Biqi Capsules significantly reduced the levels of NO and TNF-αproduction in LPS-stimulated RAW264.7 （ P＜0.01） ， and the effect of aqueous extract of Biqi Capsules had themost effective anti-inflammatory action than that of petroleum ether extract and n-butanol extract in the dose-dependentmanner.The results of real-time RT-PCR showed that iNOS， COX-2 and IL-6 mRNA expression decreased.CONCLUSION These results demonstrate that all three Biqi Capsule extracts have anti-inflammatory effects， with aqueous extract being themost effective.

Biqi Capsules； extraction； macrophage； lipopolysaccharide； anti-inflammatory

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0026-005

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.007

2013-02-04

教育部新世纪优秀人才支持计划 （ NCET-09-0899）

张馨方 （1987—） ， 女 （ 满族） ， 硕士生。 研究方向： 中药学。 Tel： 15022721947， E-mail： xinfangZH2010@163.com

*通信作者： 崔元璐 （1972—） ， 男， 研究员， 主要从事中药药理学及中药制剂学研究。 Tel：（022）59596170， E-mail： cuiyl@tju.edu.cn