补肾益寿片对注射 D-半乳糖小鼠的抗衰老作用

刘明娟， 颜礼有， 范忠原， 郭积芳， 杨建雄*

（1.陕西师范大学， 陕西 西安 710119； 2.中国农业科学院特产研究所， 吉林 长春 130117）

补肾益寿片对注射 D-半乳糖小鼠的抗衰老作用

刘明娟1， 颜礼有1， 范忠原2， 郭积芳1， 杨建雄1*

（1.陕西师范大学， 陕西 西安 710119； 2.中国农业科学院特产研究所， 吉林 长春 130117）

目的 探讨补肾益寿片对 D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用。 方法 将 50 只小鼠随机分为 5 组： 对照组颈背部皮下注射生理盐水， 模型组颈背部皮下注射 D-半乳糖， 两组都用羧甲基纤维素钠水溶液灌胃； 低、 中、 高剂量 3个给药组颈背部皮下注射 D-半乳糖， 及用不同剂量的补肾益寿片灌胃。 42 d 后观察脾脏指数、 增重率， 测定血清、肝脏、 脑组织超氧化物歧化酶 （SOD）、 谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH-PX）、 丙二醛 （ MDA） 水平、 总抗氧化活力 （TAOC） 及脑组织单胺氧化酶 （MAO） 活力等指标。 结果 中、 高剂量补肾益寿片能抑制 D-半乳糖致衰老模型小鼠的增重率和脾脏指数下降， 提高血清和各脏器 SOD， GSH-PX和 T-AOC活力， 降低 MDA水平和脑 MAO活力。 结论 补肾益寿片有较强的抗衰老作用。

补肾益寿片； 抗衰老； D-半乳糖衰老模型； 超氧化物歧化酶； 谷胱甘肽过氧化物酶； 丙二醛； 单胺氧化酶； 总抗氧化活力

衰老是生物在发育成熟后随着时间的推移，而表现出的各个细胞和器官功能不可逆逐渐丧失，其机制是一个十分复杂的多环节生物学过程［1］。 自由基学说认为，随着年龄的增长，机体的抗氧化系统失去平衡，导致自由基过剩，最终导致细胞功能严重受损以至衰老、 死亡［2］。 补肾益寿片是由淫羊藿、红参、制何首乌、灵芝、珍珠、枸杞子、丹参、黄精和甘草九味中药组成的中成药。其主要功能为补肾益气，能调节老年人免疫功能趋于正常，延缓机体衰老，用于失眠，耳鸣，腰酸，健忘，倦怠，胸闷气短，夜尿频多，性功能减退等。主要组成淫羊 藿［3-4］、 红 参［5］和 枸 杞 子［6］等 均 具 有 抗 疲劳、抗氧化、抗衰老的功效。本实验通过对小鼠颈背部皮下注射 D-半乳糖建立亚急性衰老模型， 探讨补肾益寿片对衰老小鼠抗氧化指标和衰老相关指标的影响，期望为补肾益寿片用于防治衰老相关疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 健康昆明系小鼠由西安交通大学医学院实验动物中心提供， 许可证号 SCXK（陕） 2007-001， 雌雄各半，体质量 18 ～22 g； 补肾益寿片 （规格 0.4 g/片， 批号 20060306，康普药业股份有限公司） 用 0.5%的羧甲基纤维素钠制成悬浮液； D-半乳糖购自南京建成生物工程研究所； 数显恒温水浴锅 （国华电器有限公司）；Epoch 超 微 量 微 孔 板 分 光 光 度 计 （ 美 国 BioTek 公司）； 台式 高 速 冷冻离心机 （ 美国 sigma公司）；DY89-II型电动玻璃匀浆机 （宁波新生生物科技股份有限公司）。

1.2 动物分组与处理 将 50 只小鼠随机均分为 5组：对照组、模型组、补肾益寿片低、中、高剂量组， 每组10只， 雌雄各半， 用西安交通大学医学院实验动物中心提供的标准饲料分笼饲养，自由饮食饮水。适应性喂养2 d后进行实验，实验前记录小鼠初始体质量。每天上午低、中、高剂量组分别以 0.3、 1、 3 g/kg补肾益寿片灌胃， 对照组和模型组用等体积羧甲基纤维素钠水溶液灌胃；同时模型组和 3 个剂量组按 150 mg/kg剂量颈背部皮下注射 D-半乳糖， 对照组以等体积生理盐水注射， 灌胃与注射同时进行， 连续 42 d。

1.3 标本采集 给药结束后称量小鼠体质量并记录， 眼眶采血， 以 3 500 r/min 离心 10 min 后收集上层血清待测。颈椎脱臼处死小鼠后迅速取出大脑和肝脏，用冰冷的生理盐水冲洗后，取部分脑组织和肝脏组织用生理盐水分别制成 5%的匀浆，3 500 r/min离心 15 min 后取上清液待测。同时取出新鲜脾脏吸干表面水分测重，计算脾脏指数和增重率。 计算公式为： 脾脏指数 =脾脏质量 （mg） /体质量 （g）， 增重率 = （终体质量 -初始体质量） /初始体质量。

1.4 生化指标测定 血清和各组织超氧化物歧化酶 （SOD）， 谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH-PX）， 单胺氧化酶 （MAO）， 总抗氧化活力 （T-AOC） 活力测定， 及MDA和蛋白水平测定均采用由南京建成生物工程研究所试剂盒提供的方法，严格按照试剂盒说明进行操作，用超微量微孔板分光光度计（美国 BioTek，型号： Epoch） 测定吸光度。

1.5 数据处理 数据用 SPSS 18.0 统计软件采用 t检验进行分析， 以表示。

2 结果和分析

2.1 补肾益寿片对小鼠体质量、 脾脏指数变化的影响 如表1所示，模型组的增重率明显小于对照组 （P＜0.01）， 补肾益寿片低剂量组增重率与模型组相比无差异 （P＞0.05）， 中、 高剂量组的增重率明显高于模型组 （P＜0.01）； 模型组脾脏指数明显小于对照组 （P＜0.05）， 低剂量组较模型组无显著性差异 （P＞0.05）， 中、 高剂量组明显高于模型组 （P＜0.05）。

表1 各组小鼠的增重率和脾脏指数 （， n=10）Tab.1 Weight gain rate and spleen index of all groups（， n=10）

表1 各组小鼠的增重率和脾脏指数 （， n=10）Tab.1 Weight gain rate and spleen index of all groups（， n=10）

注： 与对照组比较，△P＜0.05；△△P＜0.01； 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 下表同

组别 给药剂量/（ g·kg-1）增重率/%脾脏指数/（ mg·g-1）- 30.94 ±3.41 3.75 ±0.49模型组 - 25.80 ±2.88△△ 3.31 ±0.25△补肾益寿片 0.3 25.85 ±2.47 3.70 ±0.53补肾益寿片 1 28.92 ±1.82** 3.81 ±0.55*补肾益寿片 3 28.89 ±2.25** 3.85 ±0.62对照组*

2.2 各组小鼠血清生化指标的比较 如表 2 所示， 模型组血清 SOD、 GSH-PX及 T-AOC活 力较对照组明显降低 （P＜0.05）， MDA水平显著增加 （P＜0.05）； 补肾益寿片中、 高剂量组血清SOD、 GSH-PX活力及 T-AOC能力较 模 型 组显著增加 （ P＜0.05）， MDA水 平 显 著 降 低 （ P＜0.05）； 低剂量组与模型组比较则无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠肝组织生化指标的比较 如表 3 所示， 模型组肝脏组织 SOD， GSH-PX以及 T-AOC活力较对照组显著降低 （P＜0.05， P＜0.01）， MDA水平明显增高 （P＜0.05）； 补肾益寿片中、 高剂量组肝脏组织 SOD、 GSH-PX及 T-AOC活力较模型组显著增加 （P＜0.05）， MDA水平显著降低（P＜0.05）。

表2 各组小鼠血清的生化指标 （， n=10）Tab.2 Serum biochem ical indicators of all groups（， n=10）

表2 各组小鼠血清的生化指标 （， n=10）Tab.2 Serum biochem ical indicators of all groups（， n=10）

组 别 给 药剂 量 /（ g·kg-1） SOD/（ U·m L-1） GSH-PX/（ U·mL-1） T-AOC/（ U·mL-1） MDA/（ nmol·mL-1）84.63 ±10.58 232.8 ±30.5 8.25 ±1.01 17.5 ±2.43模型组 - 71.38 ±11.04△ 198.9 ±30.8△ 6.63 ±1.78△ 20.78 ±2.79△补肾益寿片 0.3 76.03 ±9.80 217.9 ±26.7 7.34 ±1.04 18.7 ±2.51补肾益寿片 1 81.93 ±8.81* 229.8 ±26.3* 8.07 ±0.86* 17.71 ±2.32*补肾益寿片 3 83.39 ±9.12* 234.5 ±26.7* 8.09 ±0.77* 17.63 ±2.24对照组-*

表3 各组小鼠肝组织的生化指标 （， n=10）Tab.3 Liver biochem ical indicators of all groups（， n=10）

表3 各组小鼠肝组织的生化指标 （， n=10）Tab.3 Liver biochem ical indicators of all groups（， n=10）

组 别 给 药剂 量 /（ g·kg-1） SOD/（ U·mgprot-1） GSH-PX/（ U·mgprot-1） T-AOC/（ U·mgprot-1） MDA/（ nmol·mgprot-1）对照组 —193.8 ±17.3 719.7 ±79.2 1.41 ±0.13 1.55 ±0.13模型组 — 174.1 ±19.9△ 625.1 ±78.7△ 1.21 ±0.14△△ 1.77 ±0.20△补肾益寿片 0.3 178.5 ±18.6 665.9 ±71.2 1.31 ±0.17 1.63 ±0.15补肾益寿片 1 192.4 ±16.7* 695.3 ±59.5* 1.35 ±0.14* 1.59 ±0.12*补肾益寿片 3 194.2 ±20.3* 691.9 ±48.1* 1.36 ±0.11* 1.58 ±0.13*

2.4 各组小鼠脑组织生化指标的比较 如表 4 所示， 与对照组相比， 模型组 MDA水平及 MAO活力显著升高 （P＜0.05）， SOD及 T-AOC活力显著降低 （P＜0.05， P＜0.01）； 低剂量组较模型组无明显差异 （P＞0.05）； 中、 高剂量组 MDA水平、MAO活力较模型组明显降低 （P＜0.05， P＜0.01）， SOD及 T-AOC活力显著增强 （P＜0.05）。

表4 各组小鼠脑组织的生化指标 （， n=10）Tab.4 Brain biochem ical ind icators of all groups（， n=10）

表4 各组小鼠脑组织的生化指标 （， n=10）Tab.4 Brain biochem ical ind icators of all groups（， n=10）

组 别 给 药剂 量 /（ g·kg-1） MDA/（ nmol·mgprot-1） MAO-B/（ U·mgprot-1） SOD/（ U·mgprot-1） T-AOC/（ U·mgprot-1）对照组 —2.54 ±0.13 12.95 ±2.26 93.22 ±12.51 1.40 ±0.12模型组 — 2.77 ±0.21△ 15.64 ±2.28△ 80.19 ±13.83△ 1.21 ±0.14△△补肾益寿片 0.3 2.63 ±0.16 13.67 ±2.03 85.56 ±13.64 1.31 ±0.16补肾益寿片 1 2.57 ±0.14* 13.39 ±1.95* 91.80 ±9.42* 1.36 ±0.15*补肾益寿片 3 2.57 ±0.12* 12.80 ±1.82** 93.66 ±10.04* 1.37 ±0.12*

3 讨论

随着年龄的增长，由于体内的抗氧化酶活力急剧下降，因此无法及时清除体内产生的自由基，过剩的自由基使膜结构中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，生成的脂质过氧化物及其分解产物使核酸及蛋白质分子发生交联聚合，进一步造成基因突变或 DNA复制异常， 酶活力下降， 最终导致细胞功能严重受损 以至衰 老、 死亡［7-8］， 同时机 体的免疫系统也遭到破坏，这也是加速衰老的原因之一［9］。因此， 寻求清除体内自由基以及脂质过氧化产物的药物尤为重要。

3.1 补肾益寿片对小鼠体质量、 脾脏指数变化的影响 有研究表明，衰老后机体的质量以及免疫功能呈下 降趋 势［10-11］， 本 实 验结 果 表 明， 与 模 型 组相比较，补肾益寿片的中、高剂量组的小鼠体质量和脾脏质量均有显著增加，提示一定剂量补肾益寿片可以防止小鼠衰老过程中体质量的减轻和免疫功能的降低。这可能与补肾益寿片中多种成分可增强机体免疫 功 能， 从 而 延 缓 衰 老 有 关［12-13］。 中、 高剂量组小鼠增重率和脾脏指数的数据相比较无显著性差异，说明中剂量已经达到有效防止衰老小鼠体质量降低和脾脏指数减小的合适剂量。

3.2 补肾益寿片对各组小鼠血清生化指标的影响本结果表明， 中、 高剂量组的 SOD、 GSH-PX、T-AOC活力较模型组有显著性增强， MDA水平显著降低，提示一定剂量的补肾益寿片可以清除机体自由基，降低脂质过氧化物的生成，从而增强抗氧化能力，这可能与补肾益寿片中多种成分具有清除自由基作用，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的损害有关［14］。

3.3 补肾益寿片对各组小鼠肝组织生化指标的影响 肝脏代谢旺盛，富含各种抗氧化酶，本结果表明， 中、 高剂量组的 SOD、 GSH-PX、T-AOC活力较模型组均有显著性提高， MDA的水平显著性降低，提示一定剂量的补肾益寿片可以清除肝脏中过多的自由基，从而提高肝脏的抗氧化能力，这可能与补肾益寿片中的成分提高肝脏抗氧化酶活力有关［15］。

3.4 补肾益寿片对各组小鼠脑组织生化指标的影响 MAO-B是一种老化酶，机体衰老时， 脑内的MAO-B活 力 会 急 剧 上 升［16-17］， 本 结 果 表 明， 中、高剂量组小鼠脑组织 MAO-B活力相较模型组显著减弱，这可能与补肾益寿片中某些成分具有抑制脑内 MAO-B活性， 从而延缓衰老有关［18］； SOD和 TAOC活力相较于模型组显著性增强， MDA水平显著降低，提示一定剂量的补肾益寿片可以增强衰老小鼠脑组织的抗氧化活性，抑制脂质过氧化产物的形成。

综上所述， 1 g/kg补肾益寿片 （中剂量组）即可使 D-半乳糖致衰老小鼠体内的各项生化指标接近正常水平，说明补肾益寿片对小鼠具有良好的抗衰老作用，补肾益寿片对人体是否有相似的作用，值得进行研究。

［ 1 ］ 童坦君， 张宗玉.衰老机制及其学说［J］.生理科学进展，2007， 38（1）： 14-18.

［ 2 ］ 孙晓生， 杨 柳.抗衰老机制与药物的研究进展［J］.广州中医药大学学报， 2009， 26（6）： 593-597.

［3］ 曾 南，孟宪丽，张 艺，等.淫羊藿有效成分抗氧化作用研究［ J］ .中国中药杂志， 1997， 22（1） ： 46-48.

［4］ 邹 焰，陈 玮，范学良.淫羊藿、人参耐缺氧、耐疲劳及抗氧化作用的实验研究［J］.遵义医学院学报， 2001， 24（1）： 15-16.

［5］ 许海顺，蒋剑平，徐 攀，等.红参多糖抗氧化活性的研究［J］.浙江中医药大学学报， 2011， 35（6）： 909-912.

［ 6 ］ 高男男， 田 泽， 李玲玲， 等.枸杞乙醇提取物对D-半乳糖所致衰老小鼠的改善作用［ J］.时珍国医国药， 1996， 12（1）： 24.

［ 7 ］ W ickens A P.Ageing and the free radical theory［ J］.Respir Physiol， 2001， 128（3） ： 379-391.

［ 8 ］ 赵保路.自由基、 营养、 天然抗氧化剂与衰老［J］.生物物理学报， 2010， 26（1） ： 26-36.

［ 9 ］ Chen G L， Liw Z， Zhou Y， et.al.Effect of compound penetration enhancers on permeability of nimodipine through rat skin［J］ .Chin JPharm， 1998， 29（7） ： 308-310.

［10 ］ Bruce R， Troen M D.The biology of aging［ J］ .Mount Sinai J Med， 2003， 70（1） ： 3-221.

［11］ 刁 军.衰老对免疫功能影响的研究进展［J］.国外医学老年医学分册， 1991， 12（6） ： 256-260.

［12］ 孟宪丽， 李建亚， 张 艺， 等.淫羊藿多糖对老年大鼠神经内分泌免疫调节作用的研究［J］.中国药理与临床， 1998，14（3）： 19-20.

［13］ 张志远， 苗明三， 顾丽亚.制何首乌多糖对小鼠免疫功能的影响［ J］ .中医研究， 2008， 21（6） ： 18-20.

［14］ 许爱霞， 王彩琴， 杨社华， 等.制何首乌多糖和枸杞多糖的协同抗衰老作用机制的实验研究［ J］.兰州大学学报，2005， 31（2） ： 13-16.

［15］ 续洁琨， 栗原博， 郑洁静， 等.丹参酮类化合物对小鼠应激性肝损伤的保护作用 ［ J］.药学 学报， 2006， 41 （7）：631-635.

［16 ］ Nicotra A， Pierucci F， Parvez H， et al.Monoamine oxidase expression during development and aging［ J］ .Neurotoxicology，2004， 25（1-2） ： 155-165.

［17］ 裘 月， 杜冠华， 张均田.单胺氧化酶及与疾病的关系［J］.中国药学杂志， 1994， 29（10）： 596-598.

［18］ 张权生， 秦旭华.黄精水提液对老龄大鼠脑内单胺类神经递质和单胺氧化酶的影响［ J］.中医研究， 2008， 21（6）：16-18.

Effect of Bushen Yishou Tablets on aged m ice induced by D-galactose

LIU Ming-juan1， YAN Li-you1， FAN Zhong-yuan2， GUO Ji-fang1， YANG Jian-xiong1*
（1.Shaanxi Normal University， Xi’ an 710119， China； 2.Institute of Special Animal and Plant， Changchun 130117， China）

AIM To explore anti-aging effects of Bushen Yishou Tablets on aged mice induced by D-galactose.METHODS Fiftymice were random ly divided into five groups.The control group were injected subcutaneously with saline solution， model group were injected subcutaneouslywith D-galactose in the napes and backs，and then sodium carboxymethyl cellulose solution was used to fill stomachs in both.Low， moderate， and high dose groups were injected with D-galactose in the nape subcutaneously and lavage was performed with different doses of Bushen Yishou Tablets.The index of spleen， the rate of weight gain， serum， liver， brain tissue superoxide dismutase（ SOD），glutathione peroxidase（ GSH-PX） ， and malondialdehyde（ MDA），total antioxidant capacity（ T-AOC） and brain tissuemonoamine oxidase（MAO） activity were collected after 42 days.RESULTS The results showed thatmoderate and high dose of Bushen Yishou Tablets could significantly inhibit the growth rates and increase index of spleen of aged rats induced by D-galactose.They could significantly decrease the activities of SOD， GSH-PX and the activity of T-AOC， and the concentrations of MDA and activities of MAO in brain decreased.CONCLUSION Bushen Yishou Tablets have strong anti-aging effect.

Bushen Yishou Tablets； anti-aging； D-galactose aging model； superoxide dismutase； glutathione peroxidase； malondialdehyde； monoamine oxidase； total antioxidant activity

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-0909-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.005

2013-09-15

刘明娟 （1989—） ， 女， 硕士， 从事天然产物的分离、 纯化与功能评价。 Tel： 15029554385， E-mail： lmj0828@163.com

*通信作者： 杨建雄 （1954—） ， 男， 教授， 主要从事天然产物的分离、 纯化与功能评价。 Tel：（ 029） 85307619， E-mail： jxyang@snnu. edu.cn