出入境转基因产品及其分子检测现状与展望

桂国春，李克彬，畅荣妮，舒伟

1.天津出入境检验检疫局，天津 300457；2.湖北省宜昌市微生物研究所，湖北 宜昌 443000；3.广西医科大学，广西南宁530021

随着生物工程技术的发展，人类能够在多种生物体内导入外源基因并使其表达，进而通过遗传学的方法，获得使外源基因稳定表达并能遗传给后代的品系，这就是转基因生物（genetically modified or⁃ganisms，GMO）。转基因生物包括转基因植物、转基因动物、转基因微生物等。转基因产品是指含有或生产过程中有转基因生物参与的商品，主要包括一些转基因植物产品和大量以转基因生物为原料的食品或药品等。世界第一例转基因植物转基因烟草于1983年在美国问世；1986年，首批转基因植物抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验；1994年，第一个转基因植物产品延熟番茄“navrSavr”获得美国食品与药物管理局批准进入市场。

自1996年以来，转基因产品在全球迅速推广，主要为转基因植物产品，如转基因大豆、棉花、玉米、油菜等，其销售额逐年增长。1995年转基因植物的全球销售额为7500万美元，1996年比前一年增加了2倍，达到2.35亿美元，1997年又增加了2倍，达到6.70亿美元，2000年全球转基因植物的产品销售额高达30亿美元，到2010年可望增至200亿美元，可见其发展速度是惊人的[1]。我国是最早开展转基因植物研究的国家之一。到目前为止，我国有近50种转基因植物在进行田间实验和环境释放试验。我国已经获得有自主知识产权的转基因抗虫棉花。

全球转基因产品商品化飞速发展，转基因植物在国际农产品贸易中的比重逐年加大。然而，转基因植物产品在带来巨大经济效益的同时，也伴随着许多问题。转基因植物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论与普遍关注，主要集中在环境安全性和食品安全性两方面。世界各国正在努力制定相应的法律和法规。我国于2001年5月颁布《农业转基因生物安全管理条例》。2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度，凡是在中国境内销售的大豆、玉米及其制品，若属转基因生物，必须进行标识。应转基因产品生产企业、食品制造商、消费者等多方面需要，将转基因食品与常规食品区别开，这就迫切需要建立一套有效的转基因产品检测方法。随着标识制度的实行，转基因产品检测工作日益增多，各检验检疫单位根据贸易单位要求，相继开展了对出入境转基因产品的检测工作。

1 出入境转基因产品

出入境转基因产品泛指国际贸易中一切转基因生物产品或以转基因生物为原料的食品或药品等。转基因生物产品包括转基因植物、动物、微生物产品。目前市场上的转基因动物还不多，几乎没有商业化的生产。在国际贸易中的出入境转基因产品，主要是转基因植物产品和转基因食品或药品。

转基因植物种类主要有大豆、玉米、棉花、油菜，约占商品化的转基因植物产品的99%以上，此外还有转基因马铃薯、西葫芦和木瓜等，其比例小于1%。按照转入基因的性质，将转基因植物分为以下几类：①抗除草剂的转基因植物（最早进入田间生产，目前栽培面积最大），如孟山都公司的抗除草剂草甘膦大豆；②抗虫转基因植物，如先正达公司的Bt176抗虫玉米；③抗病转基因植物，如已大量商品化的抗黄瓜花叶病甜椒、抗黄瓜花叶病番茄等；④抗环境胁迫转基因植物，如一些抗干旱、抗高盐的转基因植物；⑤植物发育调节基因工程，如控制果实成熟、雄性不育等改良植物品质的植物，耐储藏番茄是最早商品化的一个转基因产品；⑥医药领域中的转基因植物，如一些利用植物作为生物反应器生产的药用蛋白、食用疫苗等转基因植物。

转基因食品或药品种类繁多，市场上的一些转基因大豆油、转基因玉米饲料、转基因番茄酱等也都是要接受转基因检测的对象。欧洲药品局于2007年6月批准一种源于转基因动物的药品在欧盟上市，是此类药物首次获准在欧洲上市。该药名为“ATryn”，由美国马萨诸塞州的一家生物医疗公司研制。这种药物是利用转基因羊的奶研制出的一种抗凝血酶，主要用于体内缺乏抗凝血酶的病人。随着科技的发展，越来越多的转基因药物将会出现，根据标识制度的要求，这些转基因产品也将接受转基因检测。

2 转基因技术的原理

转基因技术就是利用基因工程技术把外源基因导入生物体内，然后通过遗传学的方法获得稳定的转基因品系。转基因技术大致可以分为以下4个步骤：①目的基因的分离：即应用分子生物学的方法分离并克隆具有一定特性的目的基因。例如，通过筛选苏云金杆菌cDNA文库，从中获得对很多昆虫有毒的Cry9C蛋白基因，用于抗虫转基因工程。②目的基因的转化：即将获得的目的基因构建到相应的表达载体中，然后借助于不同的媒介，如农杆菌、逆转录病毒或基因枪，将含目的基因的表达载体转入接受生物体内，使目的基因在接受生物体内稳定表达。③转基因生物个体的鉴定：目的基因是否转入到生物体内，在体内是否表达，需要通过一定的手段来检测。通常，随目的基因转入的还有一个报告基因，如抗生素基因neo、GUS基因等，通过检测报告基因是否表达就可以知道目的基因是否转入植物体内并表达。此外，可以通过Southern印迹、PCR检测等方法检测外源基因的转入情况。④遗传杂交和选育：对于获得的稳定表达的转基因个体，往往还需要和具有优良性状（如高产、抗病或高品质等）的品种进行杂交和选育，从而获得既具有目的基因又具有优良性状的转基因品系[2]。

3 转基因产品的分子检测

基于转基因技术的原理和转基因产品的特性，人们设计了一系列检测方法对转基因产品进行检测和鉴定。在国内外已有的检测技术体系中，按照检测方法划分，主要分为两大类：一类是对外源重组核酸分子进行检测，另一类是对外源基因表达的目的蛋白进行检测[3]。

3.1 核酸检测

构建基因表达载体时常在目的基因的5′端加上启动子，在3′端加上终止子，以使外源基因能在植物中有效表达，同时不影响其他基因的表达。当启动子与显性选择标记基因（如新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因，neo）连接，构成嵌合基因，这些标记基因同样能表达，从而提供可筛选的表型。由于启动子、终止子、标记基因等来源于微生物，是非转基因植物所没有的，如常用的根癌农杆菌胭脂碱合成酶启动子（NOS）来源于细菌，花椰菜花叶病毒（CaMV）、玄参花叶病毒（FMV）35S启动子来源于植物病毒，标记基因如neo来源于大肠杆菌，因而只要检测材料中核酸是否存在外源蛋白和外源启动子、终止子、标记基因序列，即可判断是否为转基因产品[4]。

针对转基因产品的核酸检测方法主要有3种：一种是定性PCR检测方法，是转基因植物的主要检测方法，具有快速、灵敏等优点；第二种是实时荧光定量PCR检测方法，突出优点是能够快速、准确、定量分析样品中转基因植物的含量；第三种是South⁃ern印迹。此外还有基因芯片检测方法，该方法具有快速、高通量等特点。

3.1.1 定性PCR 最初检测转基因产品采用的是定性PCR方法。可以通过对特殊序列（启动子、终止子、遗传标记基因）和目的基因（靶基因）进行检测。在瑞典GMO标识制度中，PCR定性检测方法起着决定作用。随着各国出入境检验检疫机构对转基因生物及其产品检测结果可靠性要求的提高，简单的定性检测方法常伴有假阳性或假阴性结果，已经不能满足需要。为此，研究者们在定性PCR方法的基础上，发展了转基因生物的多重PCR检测，也称为复合PCR（multiplex PCR，MPCR）。复合PCR技术在细菌检测、病毒检测中得到了较广泛的应用。MPCR，即是在同一反应管中含有一对以上引物，可以同时针对几个靶序列或一个靶序列的多个部位同时进行PCR检测，模板可以为单一的，也可以是几种不同的样本。只要有一对引物扩增出阳性结果，就可以判断为转基因产品。这样可以大大提高检测结果的可靠性。陶震等选用NOS终止子、CaMV 35S启动子、NOS启动子的3对引物，利用MPCR技术对5个大豆样品和6个豆粕样品进行检测，同时利用普通PCR方法对上述样品进行复核验证，两者的结果完全符合[5]。Matsuoka等建立了一种MPCR方法来区分转基因玉米的5个不同品系[6]。珠海出入境检验检疫局利用复合PCR法，以转基因大豆、玉米、油菜、番木瓜为材料，在同一反应管中可同步检测35S、NOS及CP4-EPSPS基因，明显提高了检测效率。MPCR方法是针对多个靶位点同时进行检测，其结果较普通PCR更为可信，同时简化了步骤，节约了试剂。

3.1.2 实时定量PCR（real-time PCR） 目前转基因成分的准确定量检测在国际贸易中日趋重要。定量PCR方法可用于确定样品中GMO成分的百分含量。实时定量PCR方法是普遍使用的一种定量PCR方法。包括2种方法：①非特异性染料结合法。某些荧光素能和双链DNA结合，结合后的产物具有强的荧光效应。当扩增结束后，随温度的降低，DNA复性成为双链，荧光素与之结合，激发产生荧光，测定荧光强度，通过内参或外参法求出对比因数，即可以准确定量。②杂交探针标记法。寡聚核苷酸探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团，完整的探针在激光激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，样品无荧光。但在PCR扩增过程中，Taq酶分子在链延长的过程中可以通过自身的5′→3′核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发光基团从探针上切下来而与荧光淬灭基团分开，从而在激光激发下产生特定波长的荧光，这种荧光强度随着PCR扩增过程动态增强。定量PCR仪通过动态监测荧光强度，可以得到每一样品中特定模板DNA的起始拷贝数[7]。德国推荐的转基因玉米定量检测方法就是采用实时定量PCR技术检测抗虫玉米（Bt176玉米）。Heide等使用实时定量PCR，完成了8个转基因玉米食品的定性定量检测[8]。

3.1.3 Southern印迹 Southern印迹技术是用一段已知DNA片段来检测未知样品是否含有这段已知DNA序列，在转基因产品检测中这个已知DNA片段为外源基因序列。凡含有外源基因序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异性杂交体，最后根据杂交体的放射性质或发光性质进行检测。Southern印迹具有灵敏性高（可检出1 pg DNA样品）、特异性强（可鉴别出20个碱基对左右的同源序列）的特点，是当前鉴定外源基因整合的权威方法，因此在转基因产品检测中也常被用到[9]。

3.1.4 基因芯片 基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列，是指将许多特定的核苷酸片段或基因片段有规律地固定于支持物上形成的DNA分子阵列，然后与待测产品的DNA荧光标记样品按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对其表面进行扫描，即可获取样品分子的数量和序列信息，并由计算机进行分析、综合处理。国内外一些公司已生产了转基因产品检测基因芯片，用于检测转基因生物中常用到的启动子、终止子、筛选基因、报告基因及常见的目标基因（如抗虫基因、耐除草剂基因）等[10]。

3.2 蛋白检测

外源基因在转基因生物体内一般会表达出蛋白质，针对这些表达的外源蛋白质，人们设计了一系列的检测方法。

3.2.1 酶联免疫吸附分析 酶联免疫吸附分析（en⁃zyme-linked immunosorbent assay，ELISA）就是将抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化反应相结合，根据酶作用于底物后的显色反应对抗原抗体反应结果进行判断；当抗原与抗体结合时，偶联酶会形成有色物质，颜色的深浅与样品中抗原的含量成正比，据此可定性判断样品中目的蛋白的含量。进行定量检测时，需要做出已知转基因蛋白成分浓度与吸光度（D）值的标准曲线，然后根据标准曲线由未知样品的D值来确定样品中转基因成分的含量。Lipp等使用ELISA方法，通过抗体特异性地与来源于农杆菌CP4的EPSPS（烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶）结合，检测抗农达转基因大豆[11]。现在成功研制的外源蛋白检测试剂盒，已广泛应用于定量检测Bt转基因水稻、棉花、玉米、大豆。赵红盈等用此试剂盒检测了cryl Ac/CpTI双价抗虫水稻不同时期、不同部位中Bt杀虫蛋白的含量。

3.2.2 试纸条 试纸条法是另一种利用抗原抗体结合原理检测的方法，是将特异抗体交联到试纸条和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，试纸条上就有颜色反应，如没有抗原则没有颜色。美国检测Starlink玉米中Cry9e蛋白的试纸条已成为美国的官方检测方法[9]。

3.2.3 Western印迹 从检测样品中提取总蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（一般为硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，随后将膜在牛血清白蛋白溶液中温浴，以封闭非特异性位点，接着加入目的蛋白的特异性抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的酶标记过的二抗，最后通过二抗上标记化合物的发光或显色特性进行检测。根据检测结果，可得知被检样品内目的蛋白表达与否，并粗略估计浓度[9]。

3.3 其他检测技术

3.3.1 色谱分析 当转基因产品的化学成分较非转基因产品有很大变化时，可以用色谱技术对其化学成分进行分析，从而鉴别转基因产品。再者，有一些特殊的转基因产品（如转基因植物油等），无法通过传统的外源基因或外源蛋白质检测方法来进行检测，而借助色谱分析技术可以对样品中脂肪酸或甘油三酸酯等各组分进行分析，以达到转基因检测的目的[12]。

3.3.2 生物传感器技术 生物传感器是将探针或配体固定于传感器芯片的金膜表面，含分析物的液体流过传感器芯片表面，分子间发生特异性结合时可引起传感器芯片表面折射率的改变，通过检测表面等离子体共振（SPR）信号的改变而监测分子间的相互作用[12]。

3.3.3 近红外线光谱分析法 转基因过程有时会使植物的纤维结构发生改变，通过对样品的红外光谱分析，可对转基因植物进行筛选[12]。

4 转基因产品发展趋势及其检测方法展望

4.1 转基因产品发展趋势

随着生命科学研究的发展，人们对基因的认识越来越多，对其功能的了解越来越深入。人类不断认识到更多的具有特殊功能的基因，这些基因可以作为转基因生物工程的材料，用于制造转基因抗虫抗病植物、改良的转基因品质植物或转基因药物动物等。随着转基因生物工程的不断发展，将会有越来越多的转基因产品进入人们的生活中，尤其是利用一些品质改良的植物或转基因动物制造的产品在食品和药品中占的比重将越来越大。

在全球化背景下的国际贸易中，技术发达国家研究的优良品质的转基因产品在国际贸易中将逐步增多。可以展望，在未来的10年中，转基因食品和转基因药品将被发达国家一些先进的技术公司广泛引入人们的生活中。如加拿大完成了表达水蛭素的转基因油菜的商业开发，利用转基因油菜种子生产的水蛭素已作为药物使用。这是完成商业开发的第一个转基因药物[13]。美国Sigma-Aldrich公司生产的重组抗生物素蛋白，也是从转基因玉米中表达、生产并提取的。迄今，已成功地在烟草及向日葵中表达了人生长因子，在烟草和马铃薯中表达了人血清白蛋白，在烟草中表达了人促红细胞生成素、胶原，在水稻中表达了α干扰素，在玉米中表达了抑肽酶等。此外，一些常用药物，如胰岛素、脑啡肽、人凝血因子、白细胞介素和胸腺素等也在转基因植物中获得表达。可以期待，在不远的将来，一系列转基因药物将会逐步得到商业开发，走进人们的生活，并进入国际贸易[14]。

4.2 转基因产品检测标准化与委托鉴定

随着转基因产品的不断问世，新型的外源基因将不断增加，转基因产品的检测方法也会不断得到改进。许多国际组织对转基因生物检测问题高度重视，在组织内部设立专门机构负责转基因生物检测技术标准化工作，如联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）、世界经济发展合作组（OECD）、世界贸易组织（WTO）、国际食品法典委员会（CAC）、国际标准化委员会（ISO）和欧洲标准化委员会（CEN）等。世界各国也相继成立专门机构或在相关机构中设立专门部门，负责转基因生物安全检测技术标准化工作。1997年以来，欧盟从抽样、核酸提取、蛋白检测、核酸检测等方面开展了系统研究，形成了成熟的检测方法和技术体系，建立了完善的方法验证程序和平台，对已建立的检测方法和技术体系开展了系统验证。在转基因产品检测技术标准化方面，欧盟走在世界前列，已建立了比较完善的技术体系，包括检测信息收集、技术研究、方法验证、标准制定、实验室水平测试与认证等；同时，针对获得纯合的阳性或阴性转基因植物材料比较困难的实际问题，开展转基因产品检测标准物质研制工作，建立了比较完善的转基因产品检测标准物质研制程序，目前已制备出近20种转基因产品的标准样品[15]。

标准化的检测程序还不能最终确保世界各地的实验室对同一批转基因产品的检测得到一致的结果，因为不同实验室对检测的实施由于环境条件和操作熟练程度不一样可能导致检测结果会有差别。委托一些公共认可的、权威的试验室专门从事某种类型的转基因产品的鉴定，能够有效解决这个问题，并且标准化的检测程序在同样的检测条件下实施，其检测结果将更具有可比性。委托鉴定不仅可以使检测结果更加可靠更具有可比性，而且由于规模化和专业化，可以大大降低检测成本[16]。

基因工程的发展使转基因产品越来越多地进入人们的日常生活。转基因产品的安全性问题正受到社会各界的关注，而各国政府建立的转基因标识制度能否顺利实行的关键就在于能否建立准确可靠的转基因检测技术。总之，标准化、高灵敏度、高通量、自动化、低成本是转基因检测技术的发展趋势。

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