p53基因及其功能研究进展

李文娟，潘庆杰，李美玉

青岛农业大学 动物生殖发育与基因工程研究所，山东 青岛 266109

抑癌基因包括Rb基因、p53基因、NF-1基因、WT基因、结肠腺瘤性息肉（APC）基因和结肠癌缺失（DCC）基因等[1]，其中前两者为最重要且最为人了解的2个基因。自发现p53基因以来，人们对该基因的认识逐渐深入。p53基因家族包括p53、p63、p73基因。有研究显示，在p53激活Bax、PARP通路和细胞凋亡的过程中，TAp63和TAp73起重要作用，也就是说p53、p63和p73之间存在相互作用。其中，p53基因在细胞应激和肿瘤抑制中起关键作用，该基因有DNA修复、阻滞细胞周期、抑制血管生成、导致细胞凋亡等作用。调查发现，在人体发生的所有恶性肿瘤中，有一半以上会出现p53基因的突变或缺失，说明该基因在人类肿瘤的发生上有重要作用。因此，自1979年Lane[2]等发现该基因以来，各国科学家对该基因及其功能进行了大量研究。在此，我们简要阐述国内外对p53基因及其编码产物的研究现状。

1 p53基因的结构和作用机制

1.1 p53基因的结构

人类p53基因位于17号染色体短臂1区31带，即17p13.1，由11个外显子和10个内显子组成，其cDNA全长2074 bp，有单一开放读框，其中第1个外显子不编码，其上游400 bp处有启动子p1，下游1 kb处有启动子p2，两者为转录起始点，第2、4、5、7、8外显子分别编码5个进化上高度保守的结构域[3]。其下游基因主要包括 p21、MDM2、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIPI、pig3、Cyclin G等[4]，并直接影响了p53基因的多样性。p53分为野生型和突变型，野生型p53为正常的p53基因，其突变方式包括点突变、缺失突变、移码突变、基因重排等。野生型P53蛋白的半衰期很短，用免疫组化很难检测到；而突变型P53蛋白的空间构象发生改变，半衰期延长，用免疫组化可以检测出，因此当检测到组织中P53蛋白表达量高时，可以判断为突变型P53基因。P53蛋白主要包含3个功能区域，即N2末端转录区域（TAD）、C2末端寡居区域（OD）和核心区域（DBD）[5]。由于DBD可以结合特异序列的DNA，因此最为重要。

研究发现p53基因的3个多态性位点与雌激素代谢相关的肿瘤疾病有关联[6]：p53基因第4外显子72位密码子具有GGT/CCT单核苷酸多态性，使编码的精氨酸被脯氨酸取代，与多种肿瘤的易感性有关；第3个内含子区16 bp的插入序列5'-GACCTGGAG⁃GCTGGG-3'多态性，有该序列的等位基因是A'，无该序列的为A，前者较罕见；第6内含子的MspⅠ限制性酶切位点G/A单核苷酸多态性，其中第一种与肿瘤相关性的研究最多。第4外显子编码的精氨酸和脯氨酸均为野生型，稳定性相同，空间构象和P53抗体的结合表位相似，但分子生物学行为和功能不完全相同。P53脯氨酸型蛋白与部分转录因子的结合较强，可能更有效地激活转录，使下游基因表达上调，而P53精氨酸型蛋白则能较好地抑制转化细胞的生长、诱导细胞凋亡，以及对细胞损伤进行修复[7]。

1.2 P53蛋白的作用机制

p53基因转录生成全长2.5 kb的mRNA，后者编码的蛋白含393个氨基酸残基，相对分子质量为53×103。p53基因可调节大量靶基因的表达，进而影响细胞周期组织、凋亡、分化、静息、DNA损伤、血管生成和转移的抑制及其他功能[8]。

野生型P53蛋白有抗细胞增殖的作用，抑制细胞生长和分裂，使其停留在G1期而不进入S期。其作用机制为：由于野生型P53蛋白可通过抑制细胞的生长，为细胞内DNA修复酶修复损伤DNA争取更多的时间，避免DNA突变在染色体上的积累，如果损伤的DNA太严重而无法修复时，P53会触发凋亡系统调控受损细胞凋亡。野生型P53蛋白具有上调CDK抑制剂p21WAFI/CIPI基因转录的生物学效应，进而降低CDK的活性，不能磷酸化Rb进而使细胞停留在G1/S期。该蛋白还可以与增殖细胞核抗原（PCNA）共同作用，降低DNA聚合酶的活性，使损伤细胞的DNA复制过程停止，进而开始DNA的修复[9]。

P53联系着不同的细胞应急和细胞应答，受离子辐射、化学药物及异常的细胞信号的刺激而得以表达，表达升高后受到p53-mdm2、p14ARF-mdm2环路的精确调节。已开发出一种能干扰p53-MDM2复合物形成、促进P53蛋白释放并诱导细胞周期停滞或促进细胞凋亡的类似P53蛋白的多肽[10]。而Svane等[11]已研制出结合了P53肽段的树突细胞疫苗，临床发现P53表达增高，有三分之一的患者病情稳定或轻度消退。

2 p53基因表达的检测

通过对p53基因及其产物的监测，可以对肿瘤做出早期诊断和预测，并且可以对肿瘤的发生、发展和预后做出科学推断。

2.1 纳米探针检测

由于纳米金颗粒具有表面效应、小尺寸效应及较好的生物相容性，因此日益受到人们的关注[12]。1971年Faulk和Taylor[13]用免疫金与兔抗沙门菌抗血清结合检测表面抗原，纳米金作为一种免疫标记技术开始快速发展。苏州大学黄云艳的毕业论文中提到使用标记了P53捕捉抗体的纳米磁珠来富集和分离血清中的P53蛋白，然后用标记了P53检测抗体和HRP的纳米金探针检测已富集的P53蛋白。用IgG-Au-DNA-HRP型探针检测P53蛋白，当HRP分子和P53抗体的比例为2.5∶1时效果明显。

2.2 免疫组织化学检测

免疫组织化学法的原理就是利用特异性抗体与P53蛋白发生抗原抗体显色反应，根据显色斑点的有无和强弱，间接判断P53蛋白的有无或多少。该方法得到了广泛应用[14-15]，但不能大批量筛查样本。

2.3 利用同位素免疫检测

可以利用同位素标记进行抗原抗体反应来检测蛋白质。放射性同位素标记物的显示具有高灵敏性，抗原抗体反应具有高特异性，两者结合起来检测P53蛋白，精确性高，样品用量少，且易规范化和自动化[16]。

2.4 流式细胞仪检测

有研究证明，用流式细胞仪可以双参数分析P53蛋白和DNA的关系[17]，该实验用DO-1单抗标记P53蛋白，用PI染色DNA，结果证明可以用该方法测定P53蛋白。

2.5 组织微阵列检测

组织微阵列又称组织芯片，是将若干石蜡包埋块上的各种典型组织转移到一个新石蜡块上重新构建微型化高通量组织阵列的方法。用该方法可在一张玻璃板上排列成百上千个组织标本，进而研究组织标本DNA、RNA或蛋白质的表达。可以用该法测定P53蛋白，具有数据量大、微型化、自动化和节省劳动力等优点。

2.6 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本过程是将抗原（抗体）吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。检测P53蛋白可采用双抗夹心法，原理仍然是抗原抗体特异反应，洗脱未结合部分，显色显示P53蛋白含量。实验证明该方法敏感性强，特异性、重复性和稳定性好[18]。但该方法有容易出现假阳性和操作繁琐等缺点。

3 p53基因的功能及应用研究

3.1 p53基因的功能

p53基因的具有阻滞细胞周期的作用。p53基因可以调节细胞周期中G1和G2/M期校正点的监测，与转录激活功能密切相关，p2IWAF/CIPI基因是p53的下游基因，该基因编码的蛋白可以与一系列Cyclin-CDK复合物结合，导致高磷酸化Rb蛋白堆积，进而抑制E2F转录因子活性，使G1期阻滞。

p53基因还具有促进细胞凋亡的作用。p53基因可以通过Bax/Bcl-2、Fas/Apo1、IGF-Bp3等蛋白调控细胞凋亡，还可以通过死亡信号受体蛋白如TNF受体和Fas蛋白途径诱导凋亡。有学者认为p53还可以直接刺激线粒体释放高毒性的氧自由基引发凋亡[19]。

p53基因可以维持基因组稳定。P53参与DNA的修复过程，切除错配核苷酸结合和调节核苷酸内切修复因子的活性，如XPB因子和XPD因子。还可以利用自身3'→5'核酸外切酶活性与p21WAFI、GADD45和PCNA形成复合物发挥作用。

p53基因可抑制肿瘤血管生成。当肿瘤生长到一定程度以后，能通过自分泌途径形成促血管生成因子，刺激营养血管在肿瘤实质内增生。研究发现p53基因可调控下游多个基因的表达，刺激抑制血管生成基因的表达，进而起到抑制肿瘤血管生成的作用，因此在各种肿瘤疾病的研究中发挥重要作用。

3.2 p53基因在胆管癌中的研究

对胆管癌的研究发现，p53基因的突变均发生在高度保守区，主要分布在CPG位点，由G∶C向A∶T转化。Head等[20]进一步证实胆管癌细胞中的p53基因第272～282密码子存在错义、插入及缺失突变。

3.3 p53基因在肝癌中的研究

研究证明，p53基因的突变与肝癌的病理密切相关，突变率与肝癌分化呈负相关。此外，p53基因的表达还与肿瘤生长与浸润有关，有实验证明浸润性肝癌P53蛋白的表达显著高于非浸润性。有研究发现p53基因249位点的突变与肝癌转移发生率、肿瘤包膜完整性、有无肝内播散结点、是否为多发病灶等密切相关。

3.4 p53基因在胃癌中的研究

胃癌中最常突变的抑癌基因就是p53，不同类型及不同病因所致的胃癌患者，该基因的突变率不同。p53基因的突变和过表达发生在癌变的不同阶段，在晚期胃癌和转移者中更常发生，而不完全结肠化生和异型增生也有较高的检出率。在肠型胃癌中，p53基因突变以无义突变、内含子突变、沉默突变常见，且突变率高于弥散性胃癌。此外，有萎缩性胃炎病史的患者，该基因的突变率也明显较高。

4 p53基因的研究前景

自p53基因被发现以来，对该基因细胞调控方面的研究取得了一些进展。有研究发现ONXY-015系统可以定位并杀死高表达p53变异基因的靶细胞，而且不损伤表达野生型的细胞。也有研究发现糖-胆固醇的去泛素化作用不仅可以通过增加p53的稳定性而引发细胞增殖抑制和细胞凋亡，还可以激活p53家族通路。糖-胆固醇的去泛素化作用还可以激活Pinl，全面活化p53，诱导细胞凋亡[21]。

对p53基因的研究开始应用于癌症的临床治疗上。用野生型p53基因转染肿瘤细胞，可能有效抑制肿瘤的生长，并且脂质体转染p53动物模型已构建成功，已开展通过重组腺病毒介导的p53基因来治疗恶性肿瘤。研究发现，p53可以通过诱导细胞周期捕获、细胞凋亡和DNA修复而提高肿瘤细胞对放疗、化疗和热疗的敏感性，所以，如果利用该基因和传统的化疗等手段联合使用，会取得较好的治疗效果。肿瘤基因治疗方法的不断深入研究发现调节肿瘤细胞最有效的途径就是转染那些失活的肿瘤抑制基因，而p53能通过诱导细胞周期捕获、细胞凋亡和DNA修复，从而提高肿瘤细胞对放疗、热疗和化学药物的敏感性，这些优点使p53基因的功能在肿瘤的治疗和预防方面得到越来越多的关注。

随着对p53基因的研究，更多治疗肿瘤的新思路被提出：下调突变型p53基因的活性与表达；引入特殊的细胞因子，抑制肿瘤的恶性表型，进而使癌细胞转为正常的细胞；采用点突变，修复突变基因或使突变基因失活。

随着p53基因网络的提出，人们将对P53在各种癌症中的作用机制进行更深入的研究，不是孤立地观察各个基因，而是结合起来分析。相信该基因的作用将会得到更好的阐述，同时会充分利用P53功能及突变寻找更有效的载体，提高转染率，开发更多的可有效治疗各种癌症的药物。

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