布地奈德对支气管哮喘患儿外周血干扰素-γ、白细胞介素- 4和叉状头状螺旋转录因子3的影响

陈　琪，张亚琼，叶　斌，郑蓓佳，陶俊儒

(台州市中心医院医学检验科，浙江台州 318000)

ChinJAllergyClinImmunol，2014，8(3)：200- 204

哮喘是儿童期最常见的慢性疾病之一，2005年全球哮喘防治创议方案将儿童哮喘作为特别难于诊断的哮喘类型之一[1]。近年来，我国儿童哮喘患病率有明显上升趋势，严重影响儿童的身心健康，也给患儿家庭和整个社会带来沉重的精神和经济负担。糖皮质激素是最有效的抗变态反应炎性药物，而布地奈德目前唯一可以雾化吸入的糖皮质激素。布地奈德雾化吸入后能调节细胞因子表达水平，抑制呼吸道炎性反应，明显改善哮喘症状[2-3]。

支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T细胞等多种炎性细胞及细胞因子参与的慢性气道炎性反应，辅助T细胞(T helper cell，Th)1Th2平衡的破坏在哮喘的发病机制中扮演着重要的角色[4]。近期研究提示，调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)也可能参与了哮喘的发病；而叉状头状螺旋转录因子3(transcription factor FoxP3，FoxP3)在Treg细胞的发育过程中发挥重要的作用。

通过检测受试患儿应用布地奈德后干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素- 4(interleukin- 4，IL- 4)、Treg及FoxP3的表达变化，探讨布地奈德对支气管哮喘患儿外周血IFN-γ、IL- 4及FoxP3表达的影响。

对象和方法

对象

2010年6月至2013年10月台州市中心医院儿科就诊的支气管哮喘患儿，诊断符合中华医学会儿科学分会呼吸学组《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》(2008年修订)标准[5]。所有患儿在入选前1个月内未口服或静脉应用糖皮质激素和其他免疫抑制剂，且无免疫性疾病病史。

根据上述指南结合临床特点将入选患儿分为轻、中、重度哮喘组。正常对照组来自台州市中心医院门诊正常体检儿童，无支气管哮喘病史、家族过敏史，无近期感染性疾病史。

上述研究得到台州市中心医院伦理委员会批准。

观察指标

检测轻、中、重度哮喘组治疗前后及正常对照组IFN-γ和IL- 4水平，以及表达FoxP3的CD4 Treg及亚型比例。并行哮喘控制问卷调查。

激素治疗

给药标准：轻、中度哮喘组均给予布地奈德1 mg+复方异丙托溴铵2.5 ml雾化吸入，2次d。重度哮喘组选用雾化吸入布地奈德悬液1 mg次，每6～8小时给药1次，总疗程为1～2周。

停药标准：临床症状和体征消失，恢复至急性发作前水平，或症状明显减轻，发作频率减少，程度减轻。

主要试剂及仪器

CD4-FITC、CD25-APC单克隆抗体及同型对照，以及BD FACS Calibur配套试剂均购自美国BD公司；FoxP3-PC5标记抗体购自eBioscience公司。检测仪器为BD FACS Calibur流式细胞仪；血浆IFN-γ、IL- 4检测采用ELISA检测，所用试剂盒为美国BENDER公司原装试剂盒，购自杭州联科生物公司。

标本采集

治疗前血样采取时间为患儿就诊首日；治疗后血样采取时间为临床症状缓解后，出院前进行抽血复查。所有对象均于清晨空腹抽取静脉血2～4 ml，乙二胺四乙酸钾盐(EDTA-K2)抗凝，并及时送检。抽取肘静脉血5 ml静置1 h后，3 000 rmin离心10 min 分离血浆，-80℃低温冰箱保存。

检测方法

Treg和FoxP3检测：吸取100～500 μl加2～5 ml不含固定剂的红细胞裂解液，分离有核细胞，用磷酸盐缓冲液制成细胞浓度为1×107ml的单细胞悬液备用。多色分析法进行染色，染前按100 μl106细胞的比例加AB型血浆，4 ℃培养20 min，以阻断可结晶片段(Fc)受体。分别取EDTA抗凝全血100 μl加入2个试管，各自分别加入10 μl CD4-FITCCD8-PEFoxP3-ECD，室温下避光孵育20 min，加入红细胞裂解液1 ml，室温避光放置15～20 min，振荡混匀，1 500 rmin离心5 min，弃上清，用2 ml PBS洗涤1次，加入400 μl PBS重新浮悬细胞，上流式细胞仪检测。应用BDFACSCalibur流式细胞仪配套的cellquest软件获取并分析10 000个细胞，同时设阴阳对照。

IFN-γ和IL- 4检测：采用酶联免疫分析法进行测定，具体操作严格按照试剂盒说明书进行操作，设双孔测定，酶标仪在450 nm波长处进行测定光密度值。

统计学处理

结　　果

一般情况

共纳入哮喘患儿68例。其中，轻度哮喘组25例，男16例，女9例，平均年龄(6.3±4.1)岁；中度哮喘组28例，男13例，女15例，平均年龄(5.3±3.8)岁；重度哮喘组15例，男9例，女6例，平均年龄(5.8±4.5)岁。正常对照组25例，其中男12人，女13人，平均年龄(5.2±2.8)岁。4组对象性别构成和年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。

哮喘组与正常对照组比较

治疗前，轻、中、重度哮喘组外周血CD4+CD25+和CD4+CD25+FoxP3+表达水平显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随疾病加重表达下降；而IL- 4表达显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随疾病加重表达增加；IFN-γ水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。轻、中、重度哮喘组治疗后上述指标与正常对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

哮喘组治疗前后比较

治疗前轻、中、重度各哮喘组血CD4+CD25+和CD4+CD25+FoxP3+表达水平显著低于治疗后水平，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)；而IL- 4表达显著高于治疗后，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前，轻度哮喘组IFN-γ表达显著低于治疗后，差异有统计学意义(P<0.05)；而中、高度哮喘组与治疗后相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

讨　　论

Treg是维持机体免疫耐受的重要调控细胞。转录因子FoxP3位于X染色体p11.23-q13.3，含有11个编码外显子，2个非编码外显子和10个内含子，在Treg细胞的发育过程中发挥重要的作用。Treg是Sakaguchi等[6]在1995年发现的T细胞亚群，该群细胞具有免疫抑制作用，在维持机体免疫自稳、免疫耐受和防止自身免疫性疾病的发生方面具有重要作用。

糖皮质激素作用机制主要是抑制淋巴细胞与巨噬细胞等免疫活性细胞对多种细胞因子的合成，抑制炎性细胞趋化，提高呼吸道平滑肌β2受体反应性，减少组胺形成[7]。布地奈德为具有高效局部抗炎作用的糖皮质激素，能增强内皮细胞、平滑肌细胞和溶酶体膜的稳定性，抑制免疫反应和降低抗体合成，从而使组胺等过敏活性介质的释放减少和活性降低，抑制支气管收缩物质的合成和释放而减轻平滑肌的收缩反应。

本研究还应用了异丙托溴铵，该药是一种对支气管平滑肌有较高选择性的强效抗胆碱药，吸入后通过降低迷走神经张力，使支气管舒张、气道分泌物减少，抑制肥大细胞释放炎性介质，从而获得平喘效果[8]。

本研究显示，布地奈德通过对哮喘患儿中FoxP3的调节，从而调节 Th1/Th2免疫平衡，以达到平缓哮喘的作用。同时，各哮喘组患儿血清IL- 4水平显著高于对照组，与疾病严重程度正相关，布地奈德治疗后显著回落，说明IL- 4的升高可能是哮喘发生的病理机制之一。IFN-γ能够抑制IL- 4对B细胞的走向调节，从而制约IgE合成，起到预防和改善哮喘临床症状的作用[9]。FoxP3作为Treg的特异性标记在哮喘患儿外周血中表达减少，且与疾病严重程度呈负相关，显示Treg是免疫抑制细胞[10]，哮喘患儿体内的免疫信号过表达，而通过布地奈德治疗后能改善这个失衡现象。

表1哮喘组与正常对照组观察指标比较

组别治疗时间CD4+CD25+调节性T细胞比例(%)CD4+CD25+FoxP3+干扰素⁃γ(ng∕L)白细胞介素⁃4(ng∕L)轻度哮喘组(25例)治疗前108±15△#47±04△#219±28△#227±27△#治疗后139±2256±08265±34181±29中度哮喘组(28例)治疗前114±14△#39±08△#205±34△290±56△#治疗后134±1749±08235±37193±28重度哮喘组(15例)治疗前99±10△#35±07△#161±32△315±33△#治疗后135±2052±09199±31196±19正常对照组(25例)—137±2054±06258±34178±16

FoxP3：叉状头状螺旋转录因子3；与对照组相比，△P<0.05；组内治疗前后比较，#P<0.05

本研究表明，布地奈德对机体免疫微环境具有优化作用，有效纠正Th1/Th2失衡，并通过调节FoxP3的表达发挥治疗作用，是其平缓哮喘的可能机制之一。

(本文图1见封二)

[1]GINA. Global strategy for asthma management and prevention：2005 update[EBOL].(2005)[2014- 04- 07].http：www. ginasthma. comGuidelinesRes-ources. asp

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[5]中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童支气管哮喘诊断与防治指南[J].中华儿科杂志， 2008， 46：745-753.

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