合作猪SLA-DQA基因第4外显子多态性分析

张国华马小军，2吕伟丽

（1.甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730037；2. 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070）

合作猪SLA-DQA基因第4外显子多态性分析

张国华1马小军1，2吕伟丽1

（1.甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730037；2. 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070）

合作猪的MHC-DQA基因的适应性变异，其抗原识别区域（即外显子4）通过PCR扩增和随后的单链构象多态性（SSCP）和序列分析，结果显示在439个合作猪个体，SLA-DQA第4外显子检出4个等位基因和6个基因型（AA、BB、DD、AB、AC和AD），其中A等位基因和AA基因型的频率最高，为优势基因和优势基因型。对不同型的PCR-SSCP条带测序分析，发现7个突变位点（5 068 bp T→C，5 109 bp和5 149 bp处缺失C，5 131 bp A→G导致丝氨酸变为甘氨酸，5 135 bp C→T，5 234 bp G→A，5 136 bp 处插入A）。遗传学分析发现，合作猪多态信息含量（PIC）为0.240 1，属于低度多态，各种基因型的分布不显著。研究结果证实，合作猪SLA—DQA基因第4外显子为低度多态。

合作猪 SLA-DQA基因 多态性 遗传特性。

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）是脊椎动物的一个与免疫应答和抗病性密切相关的高度多态基因家族，其表达产物分布于各种细胞表面，即MHC分子［1］。这种遗传变异改变了肽的编码蛋白的结合位点，使它们能够结合多种外来多肽［2］。许多研究支持了这一假设，即MHC基因的等位基因多样性是由寄生虫介导的平衡选择［3-7］。猪的MHC称为SLA（猪白细胞抗原），位于猪的7号染色体上［8］，与猪的抗病力有密切的关系。MHC分为Ш类基因，Ⅱ类基因是其中之一，编码糖蛋白在细胞表面［5］，在该基因区域中，分为两个次区域，即DQ、DR，具有高度的多态性和连锁不平衡［9］。目前，对DQA的研究集中于第二外显子，且发现其多态性可以增加仔猪断奶前后的重量和体质［10］；彭勇波［11］等研究发现，第4外显子与猪膘厚度、内脂率、眼肌高度、肌肉失水率存在明显的关系。高度表达的SLA-DQA基因的第4外显子是该基因中功能最重要的区域，其多态性较丰富［1，2］。但是，这些研究均未涉及中国甘肃省甘南州特有的地方猪种—合作猪（亦名蕨麻猪或山猪，是甘肃省甘南藏族自治州特有的地方小型猪种。该品种生长在海拔3 000米、气温最低-28.5℃的高寒潮湿半农半牧区。具有放牧性能强、抗逆性好，不惧暴晒和风雪、体型小、生长较慢、繁殖率低等特点）。有关中国合作猪SLA-DQA基因的研究，国内外鲜有报道。本试验采用PCR-SSCP和克隆测序的方法对439头合作猪的SLA-DQA第4外显子的遗传多态性检测与分析，为进一步研究合作猪MHC的抗病、易感性提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

在甘南州合作市屠宰场采集合作猪血液样品192份和耳组织样品91份，在夏河屠宰场采集合作猪血液样品156份，用冰盒带回实验室，置于-20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用常规的酚/氯仿提取法，从血样中提取DNA并溶解于TE缓冲液，在1%琼脂糖凝胶，200 V电泳检测后，放于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计及PCR扩增 采用Primer5.0引物设计软件，根据GenBank发表的苏太猪SLA-DQA基因核苷酸全序列（AY303988）设计第4外显子的核苷酸序列引物（上游引物：5'-CTCACCCCATCCCACTTA-3'，下游引物5'-AATCCTTACCTTCCCTTC-3'），扩增目的片段约为251 bp，引物由大连宝生物有限公司合成。

PCR扩增采用20 μL的体系，各成分用量：上下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，灭菌dd H2O 6.4 μL，DNA-TAQ预混酶12 μL。

PCR反应条件：预变性95℃ 1 min，变性95℃30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，35个循环，最后延伸72℃ 10 min。4℃保存，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR产物的SSCP检测 取2.5 μL PCR产物，7.5 μL变性剂（98%去离子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚蓝、0.5 mol/L混合而成），经105℃变性5 min，然后放置于冰上10 min，在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（acr∶bis=37.5∶1），4℃、200 V，电泳24 h，结束后银染法显色。

1.2.4 SLA-DQA外显子4测序 SSCP分析之后，选取不同基因型个体PCR扩增产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.5 数据统计分析 采用SPSS17.0计算各个基因型的频率、等位基因频率；用POPGNE计算纯合度（Ho）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne）；用PIC软件计算多态信息含量（PIC）；用DNAMAN进行核苷酸序列及氨基酸序列比对。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

对采集的439头合作猪DQA的外显子4进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测（图1），目的条带清晰，无杂带，片段大小为251 bp，包含完整的第4外显子和部分的第3、4内含子。

2.2 PCR-SSCP检测结果

对扩增的PCR产物进行SSCP分析，在439头个体中，检测到4种等位基因：A-D，形成了AA、BB、DD、AB、AD、AC基因型（图2）。

2.3 合作猪SLA-DQA基因不同等位基因的序列比对

合作猪DQA基因第4外显子引物扩增区域内发现的等位基因序列测定后，以苏太猪的DQA基因（GenBank No：AY303988）序列为参考基因，比对分析发现的4个等位基因（图3）。

2.4 SLA-DQA基因多态性分析

遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）是评价群体遗传变异的重要指标。合作猪DQA基因第4外显子的遗传多态性如表1所示，PIC为0.240 1，为低度多态。

2.5 合作猪SLA-DQA基因第4外显子基因型和等位基因分布及差异显著性检验

合作猪SLA-DQA基因第4外显子基因频率和基因型频率分布见表2。检测到6个基因型（AA、BB、CC、AB、AC和BC），其中，等位基因A的频率最高，为优势基因，基因型AA频率最高，为优势基因型。

χ2检验表明，SLA-DQA第4外显子在该品种中的χ2高于显著水平（P＜0.05），偏离了Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）。

3 讨论

MHCⅡ类基因的主要功能是抗原递呈和参与免疫调控（体液免疫的主要调控方式），也决定了家畜适应外界的能力。家畜所处的环境（地理环境和气候环境）是有很大差别的，为了更好地适应所处的环境，免疫系统表现出了丰富的多态，所以MHC的功能区的编码基因也相应的表现出丰富的遗传多态性。普遍研究认为，哺乳动物的MHC遗传多态性是长期进化过程中等位基因积累和融合所致［11］，多态性产生的主要机制是核苷酸的替换［12］。猪MHCDQA等位基因的多态性表现在点突变的基因序列差异之上［13］。孔晶晶等［14］在大白猪，长白猪和杜洛克猪DQA基因第4外显子分别检测出3种、4种和4种基因型，且编码区发现3个核酸突变位点：A→G，A→T，G→A；朱璟［15］在苏太猪DQA第4外显子检测出3种基因型；吴圣龙［16］在苏太猪DQA第4外显子检测出了2种基因型，二者均在编码区发现1个A→G的突变。本研究在合作猪DQA基因第4外显子区发现了6种基因型共7处突变，并且，在5 234 bp处检测到的突变与孔晶晶在大白猪、长白猪和杜洛克猪以及朱璟在苏太猪中检测到的一致。另外，检测到合作猪SLA-DQA第4外显子的6处基因突变，与中国本地的苏太猪、滇南小耳猪和云南野猪［17］（特点是生长速度快，瘦肉率和繁殖率高等），外引品种猪［14］大白猪、长白猪、杜洛克猪（特点是体型较大、生长较快和繁殖力强等）在此基因的多态性分布上有显著的差异，这可能与合作猪常年生活在高原恶劣环境下所具有的生长缓慢、繁殖率低及适应性强等特点有关。猪品种之间生长的环境、气候条件的差异，使其对外来病原体的抵抗能力的不同，导致遗传多态性的差异［18］。研究结果已证实在动物抗病育种中MHC基因是一组候选基因，而 MHC Ⅱ类基因不同基因型的猪对疾病的抵抗能力有一定的差异［19］，通过合作猪DQA 基因第4 外显子PCR-SSCP 分析发现了6 个不同的基因型，充分表明合作猪群体蕴藏着更加丰富的遗传多态性，是宝贵的遗传资源。

基因外显子的功能区中的SNPs，即功能SNPs，是导致氨基酸改变的nsSNPs对蛋白质的稳定性产生显著影响的区域［20］。本研究的氨基酸变化位于编码的跨膜区和胞质区，即5 131 bp A→G导致丝氨酸变为甘氨酸，这种突变都可能影响SLA-DQA基因的功能。

群体遗传学分析表明，合作猪SLA-DQA基因第4外显子的基因型频率偏离了Hardy-Weinberg平衡状态，表明该区域可能受到自然选择的影响，造成了基因型分布的不平衡，使A成为该品种的优势基因，AA为优势基因型。多态信息含量（PIC）和杂合度（He）是群体内遗传变异的测度［21］。对某个群体来说，PIC和He的数值越大，说明该群体内基因的一致性越差，基因的变异性也就越大；反之，其数值越小，基因变异性也就越小，该群体选择的潜力也就越小［14］。本研究发现，合作猪PIC＜0.25，为低度多态。这可能是对高原猪种而言，受所处的特殊环境的影响，使基因纯合，进而造成遗传多态性之间的差异。

4 结论

本研究中合作猪SLA-DQA基因第4外显子多态性不太丰富，属于低度多态。

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（责任编辑 狄艳红）

Analyzing Polymorphism of Hezuo Swine SLA-DQA Gene Exon 4

Zhang Guohua1Ma Xiaojun1，2Lü Weili1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2 Gansu Key Laboratory of Herbivorpous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070）

The Hezuo swine SLA-DQA gene adaptive mutation, antigen recognition region（exon 4）by PCR amplification and subsequent single-strand conformation polymorphism（SSCP）and sequence analysis . The results show that 439 Hezuo swine individual SLA -DQA exon 4 detection of three alleles and six genotypes（AA, BB, CC, AB, AC, BC）the highest frequency of the A allele and AA genotype, genotype was the dominant gene and advantages .On a different type of PCR-SSCP pieces with sequencing analysis found that the fourmutated sites（5 068 bp T→C, 5 109 bp and 5 149 bp insert C, 5 131 bp A → G cause serine into glycine, 5 135 bp C → T, at 5 136 bp insert A, the 5 234 bp G → A lead tyrosyl acid becomes cysteine.Genetic analysis：cooperation pig polymorphic information content（PIC）was 0.240 1, belongs to the moderate polymorphism；significant distribution of various genotypes .The findings confirm that cooperation pig SLA - DQA gene the 4 exon has low rich genetic polymorphism .

Hezuo swine SLA-DQA gene polymorphism Genetic characteristics

2013-08-23

甘肃省自然科学基金项目（096RJZA005）

张国华，男，硕士研究生，研究方向：动物免疫与抗病；E-mail：664802394@qq.com

马小军，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：动物免疫与抗病；E-mail：maxj712@163.com