黄颡鱼“裂头病”病原二重PCR检测方法的建立及应用

隗黎丽吴华东刘毅

（1. 江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045；2. 江西师范大学生命学院，南昌 330022）

黄颡鱼“裂头病”病原二重PCR检测方法的建立及应用

隗黎丽1吴华东1刘毅2

（1. 江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045；2. 江西师范大学生命学院，南昌 330022）

“裂头病”是黄颡鱼养殖业的主要病害之一，其病原为鮰爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌。以GenBank所收录鮰爱德华氏菌与迟钝爱德华氏菌16S rRNA基因为模板，优化设计两对特异性引物，经多重PCR反应体系优化及特异性与敏感性检测，建立了检测鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌的二重PCR检测方法。结果显示，阳性对照样品的琼脂糖凝胶电泳条带同时检测到鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌，扩增产物大小分别为470 bp及268 bp，灵敏度为1.38 ng/μL。此法用于检测江西南昌地区多个养殖场所患“裂头病”黄颡鱼脑部DNA，11份患病黄颡鱼的脑部组织均检出鮰爱德华氏菌，表明该地区黄颡鱼所患“裂头病”的病原菌为鮰爱德华氏菌，此结果与常规细菌分离鉴定的检测结果一致。所建二重PCR检测法敏感度高，特异性强，检测成本低，对黄颡鱼“裂头病”的快速诊断与流行病学调查有较好的应用价值。

黄颡鱼 裂头病 鮰爱德华氏菌 迟钝爱德华氏菌 二重PCR

黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）因其营养价值高，已成为一种名贵的淡水养殖经济鱼类。近些年来，在养殖黄颡鱼中流行一种 “裂头病”或“红头病”的疾病，主要表现为头顶穿孔，头盖骨开裂，甚至露出脑组织。国内学者对患病黄颡鱼病原研究发现，不同养殖区域的黄颡鱼病原不同，可能为迟钝爱德华氏菌［1，2］或鮰爱德华氏菌［3-5］。目前，对黄颡鱼的“裂头病”病原的检测主要采用传统的细菌分离方法，而传统的生理生化检测方法费时费力（需要7 d左右），且操作复杂，敏感性较低。常规PCR反应一次只能检测一种致病菌种，而目前可使黄颡鱼发病的致病菌的可能为鮰爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌菌，这就可能需要多次检测才能确定致病菌，使得检测时间延长，检测费用增加，延误治疗。针对这种情况，在常规PCR的基础上发展了多重PCR技术，目前已建立起针对两种或多种致病菌的多重PCR检测技术［6-11］。多重PCR技术是在同一PCR体系中加入多对引物，对多个目的基因同时进行扩增的分子生物学方法，可同时检测多种病原体或多个基因型，从而达到对多种疾病的同步诊断，缩短检测的时间［12］。为了实现对不同区域养殖黄颡鱼“裂头病”病原菌的快速检测和监控，本试验探讨建立二重PCR技术，一次性检测鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌，以期为黄颡鱼爱德华菌病提供一种快速准确、高效经济的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

柱状黄杆菌，中国科学院水生生物研究所鱼类免疫学学科组馈赠，该菌的培养条件及培养基配方参考文献［13］的方法。鮰爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均为本实验室分离株，金黄色葡萄球菌来自于江西农业大学微生物学实验室。其中，鮰爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌分别采用脑心浸（BHI）液体培养基，28℃培养24 h，嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌采用营养肉汤培养基28℃培养24 h。2×TaqPCR MasterMix购买于天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL1000购买于大连宝生物工程有限公司；琼脂糖和细菌DNA基因组抽提试剂盒购买于全式金生物技术有限公司；多重PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 二重PCR引物设计与合成 根据GenBank中已发表的迟钝爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的16S rRNA基因序列（序列号分别为AY626368和AB100170），同时参考文献［9］，利用Primer premier 5.0软件设计2对特异性PCR引物，序列见表1。

1.2.2 细菌DNA提取 细菌DNA基因组按全式金细菌DNA基因组抽提试剂盒的说明书要求提取，紫外分光光度计测定模板DNA的浓度，-20℃保存备用。

1.2.3 二重PCR反应条件的优化 将两种菌的DNA模板等量混合后，对影响二重PCR反应效果的引物浓度、退火温度以及2×TaqPCR Master浓度进行调整和优化，确定最佳反应条件。

1.2.4 引物特异性的验证 从柱状黄杆菌、金黄色链球菌、嗜水气单胞、鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌中提取DNA模板，进行多重PCR扩增，检验引物特异性。

1.2.5 二重PCR灵敏度的测定 将两种目标菌株分别培养至对数期，采用试剂盒提取DNA模板，检测二重PCR方法的灵敏度，紫外分光光度计测定模板DNA的浓度。然后将模板进行10倍系列稀释，检测二重PCR的灵敏度。

1.2.6 二重PCR方法对黄颡鱼脑组织的检测 对2012年7月至9月在江西南昌蒋巷和毛莲湖的11份临床疑似病料进行检测，11份疑似病料的病理症状均出现不同程度的头顶充血、出血、发红，颅骨顶部皮肤溃烂，鳍条基部出血，肛门及生殖孔充血、出血、外突等特征（图1）。将疑似病料的脑组织，用全式金DNA基因组抽提试剂盒进行DNA的抽提，根据说明书的具体步骤进行操作，然后采用二重PCR方法检测所抽提的DNA模板。

2 结果

2.1 二重PCR反应条件的优化

2.1.1 引物浓度的优化 先将鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌正反向引物（10 μmol/mL）等体积混合，在15 mL PCR反应体系中，添加混合引物0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μL进行二重PCR扩增，结果（图2）显示，不同浓度的引物均可以扩增出条带，条带明亮清晰，条带之间互不干扰，无拖尾，但当引物浓度增加到0.4 μL时，就可见二聚体产生，随后，引物浓度越大，二聚体越明显，非特异性扩增条带亮度明显增加。因此，最适引物添加量为0.2 μL。

2.1.2 2×TaqPCR Master浓度的优化 使用的是2×TaqPCR Master，15 μL反应体系中其添加量依次为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 μL。扩增结果（图3）显示，2×TaqPCR Master添加量为7.5 μL时扩增的条带效果最为理想。

2.1.3 退火温度的优化 为了摸索最佳的退火温度，依次设置了53、54、55和56℃作为退火温度。结果（图4）显示，退火温度在55℃时条带明亮清楚，无非特异性扩增。

2.1.4 二重PCR反应条件的确定 在相同反应条件下，本着条带较亮、二聚体较少、试剂用量较少的原则，确定反应条件。即在15 μL反应体系中，鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌上下游引物用量分别为0.1 μL，2×TaqPCR Master 7.5 μL，ddH2O 6.3 μL，鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌的cDNA模板用量为0.5 μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35个循环，72℃延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增条带见图5。

2.2 二重PCR的引物特异性

提取柱状黄杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的DNA，用所设计的引物进行扩增（图6），显示为阴性。

2.3 二重PCR反应的灵敏度

分别用紫外分光光度计测定所提取的鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌DNA的浓度，将其等浓度混合，其终浓度为1.38 ng/μL；将混合的DNA 10倍稀释，进行PCR扩增。结果（图7）显示，浓度为138、13.8和1.38 ng/μL的稀释模板可以扩增出目的条带，即该PCR方法可检测的最低的DNA的量为1.38 ng。

2.4 二重PCR对患病黄颡鱼脑组织DNA的检测

通过对2013年7月在南昌市附近不同黄颡鱼养殖场采集的11份患病黄颡鱼脑组织样本进行二重PCR检测，结果显示（图8）在11份患病黄颡鱼的脑组织中均检出了鮰爱德华氏菌。

3 讨论

影响二重PCR反应效果的因素较多，其中引物设计的好坏直接关系到PCR 扩增的特异性和成功与否。其次还需要通过调整优化二重PCR反应体系和条件参数以使多重PCR 检测效果得到最佳。本试验中迟钝爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌引物浓度在0.07-0.24 μmol/mL（添加体积为0.2-0.7 μL）之间扩增都可以出现条带。但以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且看增加引物之间形成二聚体的机会。因此，确定最优化的引物浓度为0.1 μmol/L，即15 μL PCR反应体系中迟钝爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌引物的添加体积分别为0.1 μL。

二重PCR反应体系中同时进行多个扩增反应，不同反应之间对TaqDNA聚合酶存在竞争，将会使效率相对较低的DNA扩增受到抑制。在二重PCR体系中加入适量TaqDNA聚合酶可以减弱抑制作用。本研究中使用的是2×TaqPCR Master扩增试剂盒，该试剂盒包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂、浓度为2×。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。

为了降低成本和寻找最佳的反应浓度，本试验设置了不同的15 μL反应体系2×TaqPCR Master添加量分别为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 μL，结果发现均能扩增出条带，但是浓度太低，条带则不亮，而浓度太高，又发现有非特异性扩增，因此，在15 μL PCR反应体系中2×TaqPCR Master的添加量为7.5 μL。

退火温度决定PCR特异性与产量，退火温度过高会导致引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降，退火温度低，PCR反应的产量提高，但过低可造成引物与模板错配，易出现非特异性扩增。本试验中，设置了53、54、55和56℃ 4个退火温度，结果发现除了56℃扩增时，条带不明显外，其他均能扩增出条带，但综合考虑，用55℃扩增时，条带稳定性强，可获得很好的扩增效果。

通过对患病黄颡鱼脑组织样本进行二重PCR检测，结果均检出了鮰爱德华氏菌，这与我们采用传统细菌分离鉴定的方法（已投稿）检测的结果相符。此外，本试验的灵敏度达到了1.38 ng/μL，显示该方法是很灵敏的。因此该技术不但可以用于对该病的诊断，而且还可以用于带菌鱼的诊断。

4 结论

本研究建立的二重PCR方法操作简单，快速，具有很好的特异性，能够准确鉴定和区分鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌两种菌，可以应用于临床样品中鮰爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌的单个或混合感染的检测。

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（责任编辑 李楠）

Establishment and Application of Duplex PCR to the Pathogen of“Cracked Head” from Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）

Wei Lili1Wu Huadong1Liu Yi2
（1. College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045；2. College of Life Sciences，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022）

“Cracked head disease” is one of the major diseases in cultured yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）. In this study, two special oligonucleotide primers for duplex PCR amplication were designed to detect the pathogen of“cracked head disease”from yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）. The reaction conditions of the duplex PCR were optimized and PCR products were sequenced. Specificity and sensitivity of duplex PCR were studied. Finally, the duplex PCR is well developed successfully allowing the detection of the two bacterial pathogens in one PCR tube with relatively equal intensities DAN bands when analyzed in an agarose gel. The result showed the expected DNA fragments of 470 bp and 268 bp were observed, respectively. The sensitivity of duplex PCR was 1.38 ng/μL. When it was applied to detect the bacterial in brain of fish which were naturally infected in Nanchang, Jiangxi Province, Edwardsiella ictaluri was detected in 11 diseased samples of yellow catfish. The result was coherence with that of traditional technology of physiology and biochemistry, which showed that the duplex PCR could be used not only to diagnose the diseased yellow catfish but also to monitor the fish infected by bacteria. It can be concluded that the duplex PCR is specific and sensitive. It is a reliable tool for identification of the Edwardsiellosis with less time and cost, and it can be used in quick diagnose and epidemiology investigation of bacterial of “Cracked head disease” from yellow catfish.

Yellow catfish Cracked head disease Edwardsiella ictaluri Edwardsiella tarda Duplex PCR

2013-09-24

江西省科技厅项目（20114BAB214002，20111BBF60021，20121BBF60034）

隗黎丽，女，讲师，博士，研究方向：鱼类免疫学的教学与研究；E-mail：hbliliwei@163.com

刘毅，男，副教授，博士，研究方向：鱼类免疫学的教学与研究；E-mail：yiliusan@sina.cm