益生菌增殖因子及其效果检验方法的研究进展

鲁庆，鲁海波，刘香荣

（中南林业科技大学食品科学与工程学院，稻米及副产物深加工国家工程实验室，湖南长沙410004）

益生菌增殖因子及其效果检验方法的研究进展

鲁庆，鲁海波*，刘香荣

（中南林业科技大学食品科学与工程学院，稻米及副产物深加工国家工程实验室，湖南长沙410004）

益生菌是一类与宿主互利共生、有利于宿主健康的肠道生理细菌，其增殖因子的开发也越来越多，因此增殖效果的检验方法显得十分重要。本文综述了双歧杆菌、乳杆菌等益生菌的增殖因子及其检测方法，为增殖因子的开发研究和科学的增殖效果检验方法的建立提供参考。

益生菌；进展；措施

正常情况下人体肠道中存在着大量的微生物，其中一部分能调节或维持宿主的肠道菌群平衡，对宿主的健康有益。1989年，Fuller把益生菌定义为能够促进肠内菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活微生物制剂，这是目前人们最常用的定义[1]。但经研究发现，死菌体细胞成分或代谢产物也具有与活菌相同的生理功能，所以目前通常认为：益生菌（Probiotics）是指某种微生物制剂或发酵制品能通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过改善肠道营养与菌群平衡对宿主产生有益的生理作用，它通过定殖作用改变宿主某一部位菌群的组成，从而产生有利于宿主健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物[2]。

益生菌具备以下特点：（1）黏附在宿主肠道上皮细胞上；（2）能耐受胃酸和胆盐；（3）能清除或减少致病菌的黏附；（4）能产生酸、过氧化氢、细菌素等物质，并以此抑制致病菌的生长；（5）安全、无致病性。益生菌广泛存在于人和动物的乳汁、肠道、粪便中。科学家研究发现，益生菌在肠道内达到106cfu/mL[3]，肠道才会健康，这是因为益生菌达到一定数量，能够在体内建立起一道坚固的微生态防护墙，促进营养吸收，保持肠道清洁和排便正常，同时减少毒素产生，从而抵抗衰老，真正健康长寿。并且，益生菌在肠道内所占比例越高，肠道吸收营养、阻挡致病细菌和致癌物、促进正常排便等功能就越健全，肠道就越年轻。双歧杆菌和乳杆菌是人体胃肠道内重要的益生菌，与宿主终生伴随[4]。双歧杆菌在成人肠道中约占肠道总菌数的3%～10%，在婴儿肠道占到91%以上[5]。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在肠道内的数目是评价机体健康程度的重要指标[6]。

1 研究进展

肠道菌群的组成与人体营养、免疫、癌症、衰老等有着密切的关系，促进肠道中有益菌的增殖，抑制有害细菌的生长，可以防治糖尿病等一些常见病症。因此益生菌及其制品成为研究的热点，被广泛地用于医学、食品、生物等领域，在食品领域，益生菌产品的开发越来越得到人们的重视，成为益生菌研究的主流方向，如益生菌乳制品，一些保健食品，益生元食品等。益生菌广泛存在于人和动物肠道内，对营养要求极高且生长缓慢，对氧条件苛刻，尤其是双歧杆菌，低pH的抵抗能力差，生存期较短，如何促进益生菌增殖一直是研究的热点问题。益生菌制品到消费者饮用时活菌数必须在106cfu/mL才能发挥保健功能，但在益生菌制品中很难保证消费前保持足够的活菌数。目前主要是寻找促进益生菌增殖的物质，用以提高人体内益生菌的水平，或促进体外培养液中益生菌的增殖。在人们对益生菌生长因素的研究中，发现了一种可以促进其生长的物质—增殖因子。目前，寡聚糖类、多糖类、短链脂肪酸、部分蛋白水解物和天然植物及中草药提取物已经被证实具有增殖因子作用[7]。本文主要是从人体内本身的益生菌出发，研究一些外来物质，如低聚木糖等对益生菌增殖的影响，目前对这方面的研究还不是很成熟，尤其在添加剂方面，很少见相关的报道，但是在低聚糖，植物多糖，中药合剂等方面的研究较多，并且研究大多停留在体外研究，对体内的研究较少。

1.1 体外研究

微生物体外增菌研究主要是将微生物接种于培养基中进行培养，在不同时间分别测定其重量，吸光度（即比浊法），活菌数，酸度或者采用抑菌圈来比较其生长情况，对于不同浓度的添加物也以同样的方法测定比较浓度对其增殖的影响。

1.1.1 重量法

将一离心管置于干燥烘箱中烘干至恒重，自然冷却后用分析天平称其质量m1。准确称取10mL菌液，调节pH至3，放入离心机中进行离心分离（3500 r/min、10min），倾去上清液，将菌体放进干燥箱中烘干至恒重，自然冷却后取出称重m2，利用差量法求得菌液中菌体的真实浓度。重量法作为经典的分析方法，具有准确度高的特点。但是重量分析法操作繁琐，耗时长，难以满足控制分析的需要，且在微生物操作中无菌操作困难，容易感染杂菌。该法一般不用于分析菌液浓度的变化。

1.1.2 比浊法

分光光度法测菌液浓度来比较细菌生长情况在益生菌增菌中用的比较多，该法操作简单，精确度高。刘彦亮[8]等研究了黄芪及其它中草药对双歧杆菌增菌的影响，采用比浊法，即将接种好的含中药的培养基稀释10倍，分别检测其在波长600 nm处的吸光值。再取同样的接种后的培养基37℃厌氧培养16 h后，同上稀释10倍并检测其在波长600 nm处的吸光度DD样品，求出各培养基OD的增殖ΔOD，令E=ΔOD样品-ΔOD对照，若E＞0，说明该中药品种对双歧杆菌有增殖作用，若E≤0说明该中药品种对双歧杆菌无明显的增殖作用。其体外研究结果表明黄芪浸提液在体外对长双歧杆菌Blm和两歧双歧杆菌Bbm的生长具有促进作用，将对其增殖促进效果明显的黄芪制成50%、25%、12.5%、6.25%几个浓度，加入基础培养基中比较浓度对其增殖的影响，其效果随着黄芪浸提液添加量的增加而增加，并且对不同菌种的促生长效果存在差异。

Raquel Tabasco[9]等研究了葡萄多酚对乳酸菌和双歧杆菌生长的影响，乳酸菌每隔60min测定其OD600值来评价细菌的生长情况，双歧杆菌在24 h和48 h测定吸光值的变化，将其与不加葡萄多酚的培养液OD值比较，绘制生长曲线，比较增菌变化。结果表明不同菌株之间抑菌性不同，且酚类组成也会影响抑菌活性，原花青素含量高的抑菌性也大。

刘嘉[10]等探讨辣椒中主要成分辣椒素和发酵过程中食盐质量浓度对乳酸菌纯培养物生长的影响，在MRS培养基中加入不同浓度的辣椒素样液及食盐，分别接种5种活化好的乳酸菌，在600 nm处每2小时测一次吸光值，与不加任何物质的培养基中的菌种OD值比较，发现辣椒素及食盐对乳酸菌的生长均有一定的延迟作用，辣椒素对乳酸菌抑制的最低质量浓度为0.133mg/mL，且不同的菌株对食盐的耐受能力不同。

燕卫东[11]通过加入质量浓度不同的硒培养基对乳酸菌进行培养，一定时间后迅速将培养液稀释10倍，通过吸光值探讨硒对乳酸菌增殖的影响。结果表明，硒在一定质量浓度下对乳酸菌增殖具有促进作用，当硒质量浓度在4mg/L时，菌体增殖量达到最大值。

1.1.3 活菌计数

活菌计数的方法较多，最常用的就是平板计数法，此外还有厌氧滚管计数法等。韩雪[12]等研究了几种天然提取物对两株双歧杆菌的增殖作用，将菠菜汁、卷心菜汁、平菇浸出液、胡萝卜汁、豆浆等各增殖因子分别按5%、15%、25%加入到基础培养基中，按4%接菌量接种厌氧培养16 h后平板涂布计数。采用单因素选取各提取物的最佳增殖浓度，然后采取正交设计优化出各物质的最佳添加量组合。结果表明20%的平菇汁，20%的卷心菜汁，20%的豆浆，5%的胡萝卜汁可使婴儿双歧杆菌PBA活菌数增加2.78倍；10%的平菇汁，15%的番茄汁，15%的肝浸汁可使长双歧杆菌INF活菌数增加2.95倍。

段长恩[13]等探讨椰子汁（CM）对青春双歧杆菌（BFA）体外增殖的作用，将BFA接种于不同浓度的CM培养基和MRS液体培养基中，37℃厌氧培养，通过测定△OD及平板菌落数，分析BFA的体外生长情况。结果表明各浓度的CM对BFA体外增殖均起促进作用，并可以缩短该菌到达生长稳定期的时间，可以作为BFA体外培养的天然培养基。

王忠堂等研究了核黄素对双歧杆菌和芽孢杆菌增殖的影响发现：1 g/L核黄素组，在48 h后双歧杆菌活菌数增加约10倍～100倍；0.5 g/L和0.25 g/L核黄素组，在72 h内活菌数增加约10倍～390倍，并可提高悬液中双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌的长期存活率。

刘彦亮等采用比浊法同时也将Blm和Bbm按0.1%接种量分别接种于含12.5%的4种中药的基础培养基中，37℃厌氧培养，分别于12 h和16 h后进行Hungate厌氧滚管计数。用2种方法评价4种中药对双歧生长的影响。

1.1.4 酸度测量

一般是用采用pHS-3C酸度计测定pH，有时还采用酸度滴定法。舒国伟[14]等在MRS培养基中分别加入不同浓度的水苏糖、低聚木糖及低聚半乳糖，37℃恒温培养，每隔一定时间取样测定吸光值和pH，结果发现水苏糖的添加在前期能加速两歧双歧杆菌的生长，且0.8%及1.0%的添加量对该菌有一定的生长促进作用；低聚木糖的最适添加量为0.8%；添加低聚半乳糖可促进两歧双歧杆菌的生长，最适添加量为0.6%。

万荣峰，江善祥[15]研究了低聚异麦芽糖（IMO）和低聚果糖（FOS）对乳酸菌体外增殖的影响。结果显示，在体外实验中，IMO和FOS均对乳酸菌有一定生长促进作用，培养液pH略有下降，但与对照组相比，差异不显著（P＞0.05），并且在普通肉汤培养基中增殖效果更加明显。

戴远臣[16]等将山楂多糖用于保加利亚乳杆菌的增殖试验，通过测定其pH和吸光度表明山楂多糖对保加利亚乳杆菌有促生作用，并且在多糖添加量为2%，pH为6.5，温度为42℃时促进效果最好。

王成涛[17]等研究了五味中药对乳酸菌生长及保存活力的影响，结果表明：1%和2%的金银花、青蒿对植物乳杆菌及嗜酸乳杆菌的生长和保存活性有明显的促进作用，鱼腥草的作用受其浓度的影响，而黄连和板蓝根对它们的生长和保存有一定抑制作用，五味中药对嗜热链球菌生长都表现出明显抑制作用，其中以鱼腥草最为突出。

乐国伟和上海莱雀生物科技有限公司的沈会祥[18]，在不改变培养基其它成分的条件下，用两种水解度不同的大豆肽A、B替代部分或者全部有机氮源，研究其对乳酸菌生长及产酸活力以及其对乳酸菌活力保持的促进作用。通过测定pH，菌液吸光值，平板计数及滴定酸度几种指标来评价乳酸菌的生长情况。其中酸度滴定法是用标准的NaOH溶液进行，酸度=消耗NaOH的毫升数×c×10×20°T（c为NaOH标准溶液浓度）。结果显示，两种大豆肽对乳酸菌生长及产酸均有显著的促进作用，且在酸奶发酵中添加大豆肽浓度为5 g/L时，大豆肽对乳酸菌作用效果最佳，且两种肽比较，B效果更佳。

1.1.5 抑菌圈实验

该法人为主观性较大，结果不客观，可以作为评价的指标，但是一般和其它方法结合使用进行实验。田碧文[19]等研究了阿胶、五味子、枸杞和刺五加对婴儿双歧杆菌生长的影响，将制备好的菌液均匀涂布于BL血平板上，然后贴上占有这几种中药的纸片，用一个不含中药的纸片做对照，厌氧培养24 h后观察纸片周围细菌生长情况，结果发现涂有阿胶、五味子、枸杞和刺五加这几种中药纸片周围菌苔生长旺盛，说明对婴儿双歧杆菌生长有明显的促进作用。

1.1.6 其它

张桂兰[20]采用平板打洞法对青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌进行了体外生长促进实验，用无菌棉拭沾取106CFU/mL的菌液涂布接种于新鲜配制的BS琼脂表面，重复3次，每次旋转平皿约60度，使菌液均匀分布，盖好平皿。放置2min左右，待平板表面水分吸收后，用外径6mm的灭菌铜管于平板上打4个洞，并取出洞内培养基。然后在不同孔内分别加入上述不同浓度海带汁0.05mL，同时另设一对照孔，内加等量BS液体培养基，35℃厌氧培养48 h后，观察细菌生长情况。结果发现，两种双歧杆菌在含有海带汁洞口周围，菌苔生长均较为茂盛；随着离洞口的距离渐近，菌苔逐渐增厚；随着海带汁浓度的增加，菌苔茂盛程度增加，活菌数亦增多；在海带培养基中，双歧杆菌增殖12 h基本达到稳定期，与对照管比较，增殖速度快而稳定。

近几年体外试验方法大部分采用比浊法，pH测量及平板计数法，且会选择几种指标结合来评价益生菌的增菌影响，这样避免了个体差异性及方法的局限性，使得实验结果更可靠。在实验的过程中，不仅会对某种中药或者浸提液进行单因素评价，通常会选择几种添加物进行培养基的优化，选择最佳组合添加物培养基进行筛选培养。

1.2 体内研究

益生菌抑菌性研究的体内试验目前研究较少，大多是采用动物实验或者模拟胃肠道环境来测量双歧杆菌对动物胆盐耐受性，胃肠道菌群等的影响，孙纪录[21]用菊芋和清水喂养试验小鼠进行体内试验，于第0（预饲结束后）、1、2、3、4周，分别无菌采取小鼠粪便（每只0.19左右）．将其尽快加入到已称重的内装玻璃珠的稀释管中，再次称重，计算出小鼠粪便的重量。用旋涡振荡器打碎粪便，系列稀释。选择适宜稀释度，分别接种在各培养基中，按要求进行培养。于0、1、2、3、4周取小鼠粪便测定双歧杆菌和大肠杆菌数量，与对照组比较表明菊芋在体内可以促进双歧杆菌的生长，对大肠杆菌的生长和定植产生不利作用，且双歧杆菌有明显的整肠作用。

1.3 厌氧方法

现有的厌氧培养方法有厌氧罐、厌氧袋、厌氧箱和亨盖特（Hungate）厌氧培养技术等。厌氧罐和厌氧袋的厌氧效果不是很好，厌氧箱设备费用高，亨盖特厌氧培养技术是一种目前使用较多且较理想的厌氧培养方法。有些实验室还会根据实验条件设计简单的厌氧环境，如厌氧产气袋、还原剂结合厌氧罐、厌氧袋的使用等，烛缸法。孙力军[22]等研究了4种香辛料对泡菜发酵过程中乳酸菌生长的影响，采用烛缸法即将上述试管置于干燥器中，点燃一支蜡烛，用凡士林将干燥器盖密封，创造厌氧环境，待火焰熄灭后，置于30℃恒温培养箱中厌氧培养24 h，在波长480 nm处测定其OD值。结果发现大蒜、茴香、辣椒3种香辛料对明串珠菌和植物乳杆菌的生长均有明显的促进作用，且对明串珠菌的作用强于植物乳杆菌，2%的辣椒和茴香影响最强，效果最佳。

2 存在的问题

我国目前对益生菌的研究大部分停留在对其功能和作用机理的研究，且主要是体外研究，对益生菌增殖研究主要是中药及一些多糖。近年来报道中药对益生菌增殖作用的文献逐渐增加，但大多数都是将中药提取物添加到MRS或者其他培养基中，比较其菌数或者pH的变化，研究具体增菌因子的文献不多，一般都只根据中药的成分对增菌因子进行推测，认为增菌因子是中药中的多糖、低聚糖、氨基酸核苷酸、肽类或者维生素等，但很少有进一步研究的报道[23]。或者是用多糖代替益生菌培养基中的葡萄糖来比较其菌数变化等。多从人们日常的饮食中发现益生菌增殖因子，并且提取其中的具体成分进行分析，得到具体的某种增殖成分，便于从饮食中发现含有该成分的多种物质，避免重复研究。

益生菌生长对营养要求苛刻，尤其是双歧杆菌，菌种易失活，生产、运输和保存比较困难，易造成生物活性降低，在肠道内繁殖速度较慢。这样就导致双歧杆菌制剂及产品的质量较差，活菌数较少或无，在使用时用量较大，增加了成本。因此目前靠补充双歧杆菌活菌数来调节肠道功能的效果还不太理想。而在我们的研究中发现有不少食物以及调味品对双歧杆菌具有抑制作用，但是目前对饮食影响体内双歧杆菌的研究开展得很少。如果能够很好地掌握日常食物对自身体内益生菌的影响，可以很好地控制饮食，使人体内的益生菌数量保持在健康的范围内，就能很好的达到身体的保健功能，因此研究调味品等食物对人体益生菌增殖的影响很有意义。除此，还可以延长益生菌制品的货架期，如添加菌的促生长因子，加含有乳清蛋白的酸奶缓冲液，改善包装条件都对菌的存活数量有一定的提高，改变其制剂形式以增强稳定性和保存期，采用生物工程技术，对双歧杆菌菌株进行基因改良，提高菌株的耐氧性和耐酸性，培育出各方面性能都比较优良的生产型菌种。

虽然乳酸菌可以提高机体免疫功能，但也有少量资料表明某些种类的乳酸菌对机体有致病性。这可能与乳酸菌的种类、剂量、给与方式及作用机制等方面有关。因此乳酸菌提高机体免疫力等功能和作用机制还有待进一步研究探讨。所以不是所有的乳酸菌都可以作为益生菌来发挥其功效，要在一定的实验数据基础上进一步确定其作用。因此在研究的过程中不能单一的进行某种菌株的研究，来概括该菌属的性质，要考虑同种添加物对不同菌株，相同菌株不同菌龄，菌株传代后是否有影响等因素。所有对益生菌的研究需要进一步证实其在分子水平上对人体的作用机制，同时，宿主与益生菌的相互关系也有待进一步阐明，并且所有的研究都具有菌株特异性和个体差异性。

从理论上讲，用人类志愿者做体内试验最为恰当。但是由于条件限制，多数体内试验仍然用实验动物来代替人类志愿者，并且选择试验动物时应考虑到宿主的生理机能、健康状态、饮食、年龄等个体差异诸多因素的影响。还要采用不同时期多次测定以观察指标菌在整个试验过程中的动态变化，而不是通常的试验前后两次测定作简单比较。

由于比浊法采用的分光光度计测量范围有限，考虑到测量的准确性，菌液测量前一般进行稀释及离心过滤，使其测量值保持在0.3～0.8之间，并且在培养一段时间取菌液时要保持无菌操作，离心过滤时也要无菌，各种环节使其在操作过程中感染杂菌的几率增大，且厌氧条件达不到，使得测量结果不准确，尤其会影响后期的活菌计数，通常活菌计数前还会进行革兰氏染色以确定菌种。未解决上述问题，目前有研究自动检测的仪器可以设定指标进行检测，获得所需的数据，这样避免了杂菌感染且使得厌氧环境得以保持。

3 展望

随着对人体益生菌研究的不断深入，益生菌增殖因子的开发会越来越多，对于益生菌增殖因子的效果检验方法也将会克服以上存在的问题，开发出更科学与方便的方法，促进益生菌增殖因子的开发。这些将会对人们的健康饮食结构调整具有积极的作用，也有助于调节胃肠道保健食品及药品的开发，为益生菌产品的研究提供更高的平台，提高人们的生活质量。

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Research Advance on the Multiplication Things of Probiotics

LU Qing，LU Hai-bo*，LIU Xiang-rong
（College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，National Engineering Laboratory of Rice and By-products Further Process，Changsha 410004，Hunan，China）

Probiotics is intestinal physiological bacteria which is symbiotic relationship with the host and is conducive to the host intestinal physiology of the healthy bacteria.More and more proliferation factors are also deveioped now.So the test methods of proliferative effect are very important.In the present article，the proliferation factors of probiotics such as Bifidobacterium，Lactobacillus and its detection methods are reviewed. These will provide a reference for the development research of proliferation factors and the build of scientific testing methods of the proliferation effect.

probiotics；research advance；measures

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.033

2013-02-27

鲁庆（1988—），女（汉），硕士，研究方向：保健食品的研究与开发。

*通信作者：鲁海波，男（汉），教授，硕士生导师。