TFPI-2与消化道恶性肿瘤关系的研究进展*

王凤记 王庆宝

(山东省寄生虫病防治研究所，山东 济宁 272033)

组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)也称胎盘蛋白-5，又称为基质相关性丝氨酸蛋白酶抑制剂，它是丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员之一，含有kunitz型结构域，是一种蛋白酶抑制剂。最初由Jandial和Horne在双胞胎妊娠者体内发现这种蛋白，对其进行研究并命名为胎盘蛋白-5。研究发现，胎盘蛋白-5氨基酸顺序与人组织因子途径抑制物高度同源，且两者性质相似，又将其命名为组织因子途径抑制物-2。人类的TFPI-2蛋白质序列最初由Spercher研究后公布，但TFPI-2的立体结构仍不清楚，还需进一步的研究。现就近年来关于TFPI-2与消化道恶性肿瘤关系的研究进展分述如下。

1 TFPI-2的分子结构

成熟TFPI-2分子有213个氨基酸组成，由5个部分构成，含有一个富含碱性氨基酸的C端和一个富含酸性氨基酸的N端，还包括3个相连的Kunitz结构域[1]，并且每个结构域中含有3对二硫键。其中，第1个结构域与TFPI-1的同源性高达45%。但第3个结构域与TFPI-1相似性最高，为53% ；还知第2结构域的同源性为35%。TFPI-2对蛋白水解酶的抑制作用通过Kunitz结构域实现的，主要是由于第1个结构域能与Pl残端与蛋白水解酶的蛋白袋结构结合。第1个结构域的三维立体结构呈Kuntiz蛋白酶抑制剂折叠结构，它含有Arg20到Phe33双带β-sheet，也包括Trp48到Ala54的α-螺旋结构。核心区域具有高度的保守性，由3对二硫键与一定的二级结构组成。在Leu19至Tyr33的结合环中，第1个结构域与纤维蛋白酶的活性位点有关。第1个结构域，在接近纤维蛋白酶活性位点的P1残基最重要。由于第1个结构域纤维蛋白酶复合物多了2个氢键，因此两者更加牢固的结合。由于TPFI-2与恶性肿瘤侵袭转移有关，这一点将有助于为临床寻找抑制肿瘤发生转移的药物。

2 TFPI-2在人体内的分布及含量

人类的多种细胞表达并分泌TFPI-2，已知上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞含有TFPI-2。还发现人体包皮内的成纤维胶原、新生角质化细胞生成TFPI-2，脐静脉、新生表皮微血管的内皮细胞也有表达。在健康人体循环血液中TPFI-2含量非常低，健康男性血液中为0.19～0.75μɡ/L，均值是0.43μɡ/L；非妊娠女性血液中为0.20～0.90μɡ/L，均值为0.49μɡ/L，其含量与月经周期无关。妊娠女性体内，血液中TFPI-2含量明显升高。在精浆及卵泡液中，也含有少量的TFPI-2。在精浆中，TFPI-2与精子的活性有关；在卵泡液中，TFPI-2参与与卵泡的破裂过程。另外发现，肝素显著影响血液中TPFI-2的含量，使用小剂量肝素后，血液中hTFPI-2升高10～40倍，这说明TFPI-2可能与内皮细胞发生结合，当注入肝素时，TFPI-2大量释放入血[2]。研究还发现，肝素、硫酸软骨素与精氨酸相互作用影响TFPI-2的定位，已知70～75% TFPI-2与细胞外基质结合，25～30% TFPI-2与细胞相结合，在条件培养基中，TFPI-2含量仅仅0～2%。

3 TFPI-2基因与表达

人类的TFPI-2基因位于7q22，长约7Kb，包括5′非编码区、3′非编码区，还含有结构基因。有的在5′非编码区，发现多个顺式作用元件，它们调控基因表达。在-312bp到-81bp处，还发现2个SP1和3个AP1潜在结合位点，AP1上调某些细胞TFPI-2的表达，在不同的肿瘤细胞中，SP1调控TFPI-2表达量。在人类许多恶性肿瘤细胞中，常常发现编码TFPI-2基因的缺失。在胶质瘤细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞的研究中，发现TFPI-2基因表达沉默同时伴有启动子区域异常甲基化。生物信息学分析发现，TFPI-2基因的CpG岛含有核心启动子，位于转录起始点附近，CpG岛由富含CpG双核甘酸序列构成，出现CG双核苷酸数目大于60%。在几乎所有类型的内皮细胞中，发现有TFPI-2表达，在皮肤毛细血管内皮细胞中，TFPI-2表达量最高；凝血酶上调TFPI-2的表达，TNF-α、PMA、内毒素等炎症因子也有相似的作用。另外，在许多高度恶性的肿瘤细胞中，TFPI-2的表达量很低；而在恶性程度低的肿瘤细胞中，TFPI-2表达量往往较高。另有研究发现，通过MAPK信号传导通路，多种诱导因子调节TFPI-2的表达的。

4 TFPI-2与消化道恶性肿瘤侵袭转移关系研究进展

恶性肿瘤的发生发展是一个复杂过程，一般经过癌前期、原位癌及浸润癌三个阶段，经过多步骤完成，由多种基因参与的过程。根据Hanahan和Weinberg的理论，正常细胞发生癌变时，必须获得下面六种能力：①细胞无限生长的能力；②细胞生长信号自给能力；③细胞对外界生长信号的调控不敏感；④细胞逃避诱导凋亡的能力；⑤细胞发生侵袭和转移的能力；⑥持续的血管生成能力。

4.1TFPI-2抑制肿瘤的侵袭﹑转移 恶性肿瘤发生侵袭与转移时，能够降解细胞外基质和基底膜。肿瘤细胞分泌多种丝氨酸蛋白酶，参与细胞外基质的降解，成为肿瘤细胞发生浸润转移关键点。TFPI-2作为一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制物，TFPI-2抑制肿瘤细胞发生侵袭转移的机制，总结如下：1)TFPI-2能够抑制肿瘤新生血管形成，作用机制包括：①TFPI-2抑制金属蛋白酶及纤溶物的活性；②TFPI-2对血管生成因子的负性调节作用。在恶性脑膜瘤、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤等研究中，TFPI-2能够抑制新生血管的形成，因此TFPI-2能够抑制肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力[3]。2)TFPI-2诱导肿瘤细胞发生凋亡，研究发现，TFPI-2能够抑制细胞增殖，TFPI-2还能够诱导肿瘤细胞凋亡。血管内皮生长因子与细胞凋亡受体结合，导致肿瘤细胞发生凋亡。在发生肿瘤细胞凋亡时，发现凋亡蛋白BAX高表达，同时XIAP、抗凋亡蛋白Bcl-2低表达，发挥其抗肿瘤效应[4,5,6]。3)TFPI-2能够抑制基质金属蛋白酶的活性，由多种蛋白聚糖构成细胞外基质，在细胞生长分化中，在细胞发生黏附迁移时均起重要作用；并且其内环境的稳定，需要生长因子、蛋白水解酶及其抑制剂间的动态平衡。TFPI-2与基质金属蛋白酶组织抑制剂结构相似，通过多价螯和作用，氨基末端自由氨基上Zn+活化位点可与MMPs及proMMP-2发生结合，抑制丝氨酸蛋白酶及基质金属蛋白酶与细胞外基质结合，降低对细胞外基质的降解作用。可见TFPI-2能够抑制细胞外基质的降解，在肿瘤细胞发生侵袭转移时，发挥着重要的调节作用[7]。4)在TF-FⅦα复合物的形成中，TFPI-2起抑制作用。肿瘤组织表达组织因子，组织因子与FⅦα结合，形成TF-FⅦα复合物，使肿瘤患者呈高凝状态，肿瘤细胞的侵袭转移能力增加。组织因子途径抑制剂对这种效应有抑制作用，在TF-FⅦα复合物介导的信号传导途径中，TFPI-2发挥重要作用，抑制肿瘤细胞的侵袭转移。5)TFPI-2能够抑制细胞外周蛋白，TFPI-2结合补体gC1qR，调节蛋白酶、激肽原的活性，在肿瘤细胞发生侵袭转移时发挥重要作用[8]。关于TFPI-2的其他生物学作用，总结以下：①TFPI-2参与纤维蛋白溶解调控，TFPI-2能够调控多种丝氨酸蛋白酶，参与纤溶与凝聚过程。纤溶酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶的活性能够被重组TFPI-2抑制，重组TFPI-2也抑制血浆激肽释放酶和XIa凝血因子的活性。②TFPI-2能够促进细胞的增殖，成纤维细胞、表皮角质形成细胞和内皮细胞合成并分泌TFPI-2。Choi等[9]用野生型R24Q∕KD1和KD1突变体处理芥子气类似物损伤的皮肤，发现给予这两种蛋白后，伤口愈合明显加快，wt-KD1作用更为明显。Shibuya等[10]利用蛋白质组学方法，对视网膜色素上皮细胞用TFPI-2处理，前后对比研究蛋白的表达情况，发现TFPI-2可上调MDM2、C-myc和转录因子E2F3的表达，通过调控Rb∕E2F、p53 及有丝分裂原活化蛋白激酶信号转导途径，TFPI-2促进视网膜色素上皮细胞增殖。③TFPI-2保护动脉粥样硬化斑块。已知血管内皮细胞表达TFPI-2，在动脉粥样硬化组织中，也发现T细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞表达TFPI-2，TFPI-2的表达与基质金属蛋白酶水平有关，在斑块破裂和基质降解区TFPI-2含量很低；在动脉发生粥样硬化时，TFPI-2与VIIa凝血因子复合物结合，TFPI-2灭活VIIa凝血因子复合物，降低凝血酶生成，直接抑制纤溶酶，间接抑制MMP，阻断MMP降解细胞外基质的作用[11,12]。

4.2TFPI-2促进肿瘤侵袭、转移 研究发现TFPI-2对原癌基因c-fos，癌基因c-myc、mdm-2有诱导作用，TFPI-2影响视网膜母细胞瘤结合蛋白的表达。TFPI-2在血管平滑肌细胞中，TFPI-2有丝裂原的作用，平滑肌细胞中DNA合成增加，TFPI-2激活丝裂原蛋白激酶，TFPI-2使平滑肌细胞中原癌基因c-fos的表达，TFPI-2对视网膜母细胞瘤结合蛋白的表达也有一定的调节作用。c-myc影响肿瘤细胞增殖分化，mdm-2对抑癌基因p53负性调节作用，它们的表达影响肿瘤的发生[13,14]。

4.3TFPI-2与消化道恶性肿瘤 TFPI-2是一种糖蛋白，由血管内皮细胞合成和分泌，是外源性凝血途径的特异性抑制剂，是人体内重要的生理性抗凝物质。研究发现TFPI-2在发挥抗凝作用的同时, 还在肿瘤细胞浸润转移过程中有重要作用，对伤口愈合、新生血管生成及动脉粥样硬化也有一定的作用。在肿瘤细胞发生侵袭转移时，TFPI-2发挥重要的调节作用。在消化道恶性肿瘤中，其研究进展如下。

4.3.1TFPI-2与胰腺癌 胰腺癌是恶性程度很高的肿瘤之一，是发病率较高的消化道恶性肿瘤。死亡率在因癌死亡病例的第4位，胰腺癌发病率呈逐年增加的趋势。因早期诊断较困难，解剖部位复杂，手术切除率低，术后易复发转移，预后较差。Sato等[15]通过微阵列技术研究，发现在正常胰腺组织中，TFPI-2高表达， 在高侵袭性胰腺癌细胞株中，TFPI-2未表达。在TFPI-2表达缺失的胰腺癌细胞株，发现启动子区CpG岛发生甲基化，用佛波醇酯处理后，部分甲基化的胰腺癌细胞株TFPI-2的表达增加。在体外实验时，使TFPI-2的表达恢复，胰腺癌细胞的生长明显缓慢，胰腺癌的侵袭转移能力明显下降。有人在胰腺癌患者胰液标本中，发现甲基化的TFPI-2基因；而在胰腺良性病变胰液标本中，未检测到甲基化的TFPI-2基因，与Jiang等[16]的报道一致。汤志刚也报告[17]，TFPI-2的表达与胰腺癌组织学分级及其临床分期有关，中、低分化的胰腺癌组织中TFPI-2阳性表达率低于高分化的胰腺癌组织，Ⅲ、Ⅳ期的胰腺癌组织TFPI-2的表达亦低于Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌组织。因此，TFPI-2基因有望对胰腺癌诊断提供非常重要的科学依据，将来对胰腺癌的分子靶向治疗发挥着重要作用。

4.3.2TFPI-2与肝癌 原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有增高的趋势，死亡率占肿瘤死亡率的第2位。因恶性程度高，患者早期发生浸润、转移，手术易复发，预后较差。Neaud等发现在人类肝脏中的成肌纤维细胞，能够合成分泌TFPI-2，TFPI-2增强肝癌细胞的侵袭能力，通过肝细胞生长因子介导HGF/尿激酶/纤维蛋白溶酶途径，TFPI-2促进肝癌细胞的侵袭。Wong等[18]研究中，用去甲基化药物5-Aza-dC处理原发性肝癌细胞株，可以恢复TFPI-2表达。

4.3.2TFPI-2与胃癌及结直肠癌 胃癌是我国主要的消化道恶性肿瘤之一，在全球范围内我国是胃癌死亡率较高的地区之一。近年来，在世界范围内胃癌的发病率有逐渐下降的趋势，而在我国除局部地区外，还未发现明显下降的趋势，我国胃癌的发病率及死亡率均明显高于世界平均水平。因胃癌早期诊断率低，术后易复发，预后也很差。有人采用免疫组织化学方法，研究胃癌、结直肠癌中TFPI-2的表达， 发现显低于正常黏膜组织，并且随着肿瘤恶性程度增加，TFPI-2的表达逐渐降低。在胃癌组织中，浸润的巨噬细胞增加TNF-α及内毒素分泌，上调TFPI-2的表达，保持细胞外基质稳定，对肿瘤细胞侵袭转移起着重要的调节作用[19]。Hisashi Takada等[20]也通过免疫组织化学与RT-PCR方法，进一步证实了胃癌中TFPI-2的转录失活与启动子区CpG岛异常甲基化有关。

4.3.4TFPI-2与食管癌 食管癌是人类较常见的消化道恶性肿瘤之一，我国是食管癌高发国家之一，死亡率仅次于胃癌。在大多数食管癌细胞株中，TFPI-2表达缺失，研究发现TFPI-2表达缺失与CpG岛的甲基化有关，用乙酰唑胺与缩酚酸肽处理食管癌细胞株，解除CpG岛的甲基化，TFPI-2的表达增加。因此TFPI-2表达水平对判断食管癌的预后可能提供有益的帮助，并且对食管癌的治疗提供新的途径。

5 存在的问题与展望

TFPI-2作为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一，参与消化道恶性肿瘤发生发展的过程中，成为近年来分子生物学研究的新热点。在消化道恶性肿瘤的研究中，对于TFPI-2的研究已经取得明显的进展，仍需进行深入的研究。TFPI-2对多种消化道恶性肿瘤有抑制效应，也能增加一些肿瘤的侵袭性？在消化道恶性肿瘤细胞中，TFPI-2是如何发生甲基化的？TFPI-2的结构、亚型详细情况，TFPI-2是如何分解的？对于恶性程度较高的消化道肿瘤，可否寻到治疗的靶基因？随着人们对TFPI-2的深入研究，在消化道恶性肿瘤的临床诊断﹑治疗及预防中，TFPI-2可能有美好的前景。

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