细胞自噬与肝脏疾病

郭海清，陈亚利，段钟平，任 锋，张 晶

(首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069)

自噬又称细胞的自体溶解，是指隔离膜包裹胞质蛋白和细胞器形成自噬体，然后与溶酶体融合成自噬溶酶体并在其中降解的过程。自噬现象普遍存在于大部分真核细胞中，通过对细胞内变性蛋白或受损细胞器进行降解，以维持细胞内物质循环及代谢调节的稳定，在细胞生长、分化、功能执行、自我更新、衰老及死亡中发挥着重要调控功能。近期有大量研究报道，自噬与肝脏疾病的发生、发展及预后存在相关性。本文就自噬发生、演变中的分子机制及其与临床常见肝脏疾病的关系作一综述。

1 自噬的发生、演变过程及分子机制

根据降解物进入溶酶体方式的不同，细胞自噬大体分为3类，即微自噬、分子伴侣介导的自噬和大自噬。大自噬即通常所说的自噬，部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分被非溶酶体来源的双层膜结构包裹形成自噬体，最后与溶酶体形成自噬溶酶体，并在其中降解的过程。除此之外，还有非典型性自噬和新近报道的RNA自噬［1］。

自噬在生理状态下维持细胞的营养、细胞器的动态平衡，自噬参与线粒体质量控制过程［2］;在各种应激情况下，如氨基酸等营养物质耗竭、缺血缺氧再灌注损伤或病原微生物入侵等，自噬作为机体的一种适应性反应出现。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)被认为是细胞内能量和营养状态的感受器［3］，营养丰富时，mTOR可磷酸化自噬相关基因(Atg)13，高磷酸化的Atg13与Atg1结合减弱，使Atg1激酶活性下降，抑制自噬下游信号;在饥饿状态下，mTOR的活性被抑制，Atg13去磷酸化，从而与Atg1激酶紧密结合，使Atg1激酶活性增强，诱导自噬的下游信号。除mTOR通路外，还存在非依赖mTOR的自噬途径［4］，某些氨基酸通过此途径抑制自噬。最新研究表明，mTOR上游还可能受到TBC1D7蛋白的调节，其表达下调，mTOR上调，自噬信号延迟，有利于细胞生长［5］。自噬体的形成和发育成熟是自噬过程的核心机制，也是近年来自噬领域研究的热点之一。有学者认为，线粒体、高尔基体、核糖体膜，甚至细胞膜都参与了自噬体双层膜的形成过程［6］。多种自噬相关基因参与了自噬的调控过程，如Atg5、LC3和Beclin 1等。在哺乳动物细胞中，Atg12、Atg5、Atg16以复合物形式存在，形成前自噬体，存在于胞质中;在自噬泡膜的延伸过程中，一部分Atg12-Atg5-Atg16复合物定位于膜表面，待自噬体双层膜结构形成后，此复合物便从膜上解离下来，自噬体发育成熟。LC3是酵母自噬基因Atg8在哺乳动物中的同源物，自噬发生时，胞质可溶性形式的LC3-Ⅰ转换为定位于前自噬体和自噬体的LC3-Ⅱ，成为自噬体的标志分子。ClassⅢPI3K与Beclin 1形成复合物参与自噬体的形成。近期有研究表明，自噬的发生可以不依赖Beclin 1和ClassⅢPI3K而存在，称为非典型性自噬。自噬功能的完整性依赖于自噬体与溶酶体的融合，有日本学者认为，存在于成熟自噬体外膜的突触融合蛋白17介导了这种融合［7］。大分子在溶酶体/囊泡内降解成小分子单元(如氨基酸等)，然后转运到胞质被重新利用。

2 自噬与常见肝脏疾病

2.1 自噬与病毒性肝炎 体外肝细胞系和转基因小鼠的研究表明，HBV可诱导肝细胞发生自噬［8］。HBV可以增强自噬并利用自噬增强DNA的复制［9］。Tian等［10］在转基因小鼠肝脏中特异性敲除Atg5，用免疫印迹法证实了其自噬受到抑制，同时观测到血清中HBV DNA载量下降、HBeAg和HBsAg血清水平下降，HBV C基因和S基因的RNA水准下降。进一步研究发现，在野生型小鼠肝细胞内，HBV核心蛋白主要位于胞核，只有少量分布于胞质，而在基因敲除小鼠体内则从胞核弥散到胞质。自噬影响了HBV核心蛋白的定位，这对于HBV在体内复制非常重要，并可能成为治疗HBV潜在的靶向途径。HBx是HBV编码蛋白，其表达可以诱导自噬，此在转基因小鼠体内的研究得到类似结果。新近研究表明，丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白可以诱导自噬并作为自身抗损伤的保护性机制［11］。HCV感染后上调Beclin 1基因，与ClassⅢ PI3K形成复合物，是细胞发生自噬的始动因素。此外，在自噬与HCV感染患者糖代谢关系的研究中发现，HCV感染通过扰乱糖平衡或胰岛素信号转导诱发胰岛素抵抗，而自噬参与了这个过程［12］。

2.2 自噬与急性肝损伤 刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤模型最为常用，小鼠肝细胞自噬程度在两个模型中都表现为增强。但是，ConA诱导的急性肝损伤中，肝细胞和肝脏血管上皮细胞发生自噬性死亡，而脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤中，自噬对肝细胞表现出保护作用［13］。在肝癌细胞株中，IFN-γ通过增加溶酶体膜通透性，释放组织蛋白酶B和L来增强ConA诱导的自噬性肝细胞死亡［14］。孕烷X受体(PXR)是核转录因子受体，可以调节药物代谢酶和转运外源性毒物而解毒。在野生型和PXR缺陷型小鼠中，用脂多糖/D-氨基半乳糖诱导急性肝损伤，PXR缺陷型小鼠在丙氨酸转氨酶(ALT)升高、肝细胞凋亡、坏死及出血性肝损伤程度方面均比野生型小鼠更为严重，提示 PXR是一个关键的保肝因素［15］。现有的研究结果表明，在急性肝损伤中，细胞发生自噬以使其在应激状况下存活，如果应激过强或应激时间过长，细胞则发生自噬性死亡。

2.3 自噬与酒精性肝脏疾病 急性酒精性肝损伤时肝细胞通过增强自噬来减轻乙醇毒性［16］。有研究报道，小鼠快速乙醇灌胃后，通过抑制mTOR信号通路来增强自噬。慢性长期饮酒可导致脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和酒精性肝炎等疾病。乙醇暴露能够增加肝细胞自噬体形成，但抑制溶酶体功能，所以长期饮酒可以抑制肝细胞发生自噬，其机制尚不清楚，目前有两种可能的机制［17，18］:①乙醇能够显著降低腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)在肝脏中的活性，AMPK通过mTOR抑制自噬;②自噬过程需要细胞骨架蛋白如微管和微丝的参与，二者在自噬小体的形成和融合中具有重要的作作用，乙醇可以阻断二者在细胞内的运动，抑制自噬。长期摄入酒精后自噬下降，肝脏会发生一系列病理改变，如肝细胞内蛋白分解代谢减缓，Mallory-Denk小体形成，肝细胞氧化应激、脂质聚集，转氨酶升高等。另有研究表明，长期过量饮酒能够协同HCV加重肝脏损伤，HCV患者长期饮酒与不饮酒相比，感染病程更长且慢性肝炎的临床症状更严重［19］。

2.4 自噬与非酒精性脂肪性肝脏疾病 除脂肪酶途径外，脂肪发生自噬是调节细胞内脂质平衡的另一个重要途径。脂质进入自噬体后被运送到溶酶体，降解为脂肪酸。脂肪自噬水平随营养状况不同而有所改变。有研究证实，短期内脂质增加，自噬水平增强，从而使过多脂质分解，为β-氧化或其他途径提供脂肪酸［20］。相反，在慢性肥胖和胰岛素抵抗的小鼠模型中，持续性脂质上升导致肝细胞自噬水平降低，其原因可能是在生理条件下基础自噬也参与了脂质代谢，通过胰岛素—氨基酸-mTOR途径抑制自噬。Lin等［21］研究发现，自噬抑制剂氯喹增加了肝脂肪变或肝损伤，但卡马西平能减轻这种损伤。在高脂饮食诱导的非酒精性肝脂肪变中，卡马西平和雷帕霉素在减少肝脏脂肪变性中具有保护作用，说明使用药物调整自噬水平可能成为减少肝脏脂肪变性和肝损伤的一个有效策略。通过研究22例HCV感染者的肝活检标本发现，自噬参与了HCV患者肝脂肪变的发展过程［22］，脂肪变中脂质囊泡和自噬水平呈负相关，自噬体与脂质沉积(主要为未酯化的胆固醇)发生共沉淀，抑制自噬发生。

2.5 自噬与药物性肝损伤 肝脏是机体中最重要的代谢和解毒器官，药物进入体内后主要经肝脏代谢，因此肝脏极易受药物损伤。在美国，超过50%的急性肝衰竭是由药物引起的。对乙酰氨基酚(APAP)因其解热镇痛作用而被广泛应用，其治疗剂量是安全的，但食用过量会对肝脏造成严重损害。APAP过量时可引起线粒体损伤，导致肝细胞凋亡或坏死，使动物或人类肝脏功能受损。研究表明，在APAP诱导的肝功能受损的小鼠体内，使用雷帕霉素诱导自噬可以减轻肝脏损伤，用氯喹或3-甲基腺嘌呤抑制自噬则加重肝脏损伤。自噬可以清除受损线粒体，减轻APAP引起的肝细胞凋亡或坏死，但雷帕霉素并不影响APAP的代谢，说明其保护作用的位点可能位于APAP代谢的下游区域，并可能是通过线粒体自噬实现的［23］。最新研究表明，在ATG7基因敲除的小鼠中，由于自噬缺陷，APAP使ROS产生增加、线粒体膜去极化和肝细胞中JNK活化，引起严重的肝损伤［24］。环孢素A或 JNK抑制剂与APAP联合使用能够减轻自噬缺陷肝细胞的凋亡和坏死。依非韦伦(EFV)是治疗HIV最为常用的非核苷酸逆转录酶抑制剂，虽然其作用机制尚未阐明，但有研究发现它可以通过诱发线粒体功能障碍而引起肝毒性。EFV激发线粒体自噬，自噬囊泡增多、自噬相关蛋白LC3和Beclin 1表达增多。适量浓度的EFV可以诱导自噬，但浓度过高会抑制自噬，使肝细胞增生和凋亡减慢，加重肝损伤。

2.6 自噬与自身免疫性肝脏疾病 原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性胆汁淤积性肝脏疾病，其特征为血清学上的抗线粒体抗体(AMAs)阳性和组织学上的小胆管炎，伴随小胆管的广泛损伤。PBC的病因和发病机制尚不明确，有研究表明，细胞自噬可通过MHC-Ⅱ类分子递呈胞质抗原和调节T淋巴细胞动态平衡参与到PBC小胆管的损伤过程中［25］。PBC小胆管损伤过程中，自噬特异性上调，在PBC受损的小胆管细胞胞质中，LC3特异性表达。PBC早期，细胞受损信号激活先天性免疫反应，伴随肉芽肿形成、嗜酸性粒细胞反应和IgM升高。在应激的胆管上皮细胞中，异常的线粒体自噬启动针对线粒体抗原的免疫应答。线粒体自噬、细胞凋亡和胆管增生限制胆管内的炎症反应。在PBC中，自身抗体反应的靶向为Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，或者是肾上腺素能或胆碱能系统的受体，以此干扰胆管上皮细胞的凋亡和增殖程序［26］。有学者认为，胆管上皮细胞衰老、微环境发生改变也参与到PBC的病理生理过程中。

近几年自噬在分子生物学领域取得了迅猛发展，对自噬的认识已由最初的细胞水平进入亚细胞、分子基因水平。细胞自噬在机体调节中具有双重作用，既是细胞应激条件下的生存机制，也可以在一定的条件下诱导细胞发生自噬性死亡。研究肝细胞自噬信号转导中各种分子交联及寻找新的肝病治疗靶点，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。

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