口蹄疫的实验室诊断

董春霞 何 琴

(1.重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 401120；2.重庆市巴南区动物疫病预防控制中心,重庆 401320)

口蹄疫的实验室诊断

董春霞1何 琴2

(1.重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 401120；2.重庆市巴南区动物疫病预防控制中心,重庆 401320)

口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的，是一种主要感染包括猪、牛、绵羊、山羊、鹿等在内70多种的偶蹄兽的烈性传染病，对畜牧业危害巨大，被世界卫生组织列为A类传染病，在我国也被列为一类传染病，同时它也是一种人兽共患病。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，为二十面体对称的无囊膜的单股正链RNA病毒粒子，直径为26nm，口蹄疫病毒的基因约8500个核苷酸组成。口蹄疫的临床诊断比较困难，如在山羊和绵羊上，其临床症状不明显，一些种类的动物感染的口蹄疫病毒毒力较低，另外，一些病毒水泡病，如猪的水泡病、水疱性口炎病毒感染，不能单从临床上将其与口蹄疫区分开来。因此，确诊口蹄疫需要进行实验室诊断，快速而精确地对口蹄疫进行检测诊断，对于口蹄疫的防制具有重大的意义，目前，应用于口蹄疫实验室诊断的方法种类较多，主要包含免疫学诊断和分子生物学诊断两方面。

1 口蹄疫的实验室诊断

1.1 病毒的分离

采集患病动物的水泡皮、水泡液、鼻拭子、食道一咽部刮取物、抗凝血或血清、牛奶等样品。对于死亡动物，可采集其淋巴结、扁桃体、脊髓及心脏等样品。采集的样品应冰冻保存，或置于pH值为7.2～7.6的甘油缓冲液中。

病毒的分离可采用细胞培养法和动物接种法。细胞培养法的原理是将分离口蹄疫病毒接种在猪的肾细胞、PK-l5、仓鼠肾细胞等细胞系中，培养一段时间后将病毒从培养细胞中拯救出来，并测定其TCID50。接种动物时，常用的实验动物是乳鼠，需要接种8～l0只。虽然，通过接种动物可以顺利地分离出口蹄疫病毒。但是，其缺点是需要在生物安全三级实验室中进行试验，而且试验环境要求也极为严格。

1.2 血清学诊断

1.2.1 补体结合试验

补体结合试验是利用已知的抗原（或抗体）、被检的抗体（或抗原），红细胞、溶血素两个系统竞争补体的原理而建立的一种检测方法。其优点是能对口蹄疫病毒进行分型鉴定，结果判定直观、可靠。本试验的缺点是易受样品质量的影响和样品中亲补体和抗补体物质的干扰，操作程序也较为复杂。

1.2.2 ELISA

ELISA的原理是向吸附有抗原（或抗体）的固相载体中加入待测抗体（或抗原），再加入相应的酶标记抗体（或抗原），生成抗原（或抗体）——待测抗体（或抗原）——酶标记抗体（或抗原）复合物，再与该酶的底物反应生成有色底物，借助分光光度计计算抗体（或抗原）的量。目前，用于口蹄疫诊断的ELISA主要有液相阻断ELISA、间接ELIA、固相竞争ELISA、夹心ELISA四种。

（1）液相阻断ELISA

此方法的优点是快速、敏感、准确，在一般实验室操作即可进行；缺点是检测结果中有一定的假阳性，需将检测结果中阴性和可疑的血清样品再用中和试验进行进一步的确诊。

（2）间接ELISA

间接ELISA是利用2C、3AB、3ABC及3D等口蹄疫病毒非结构蛋白做诊断抗原来区分免疫动物血清抗体和自然感染动物血清抗体。其优点是特异性、准确性高，不足之处是操作过程略显繁琐。

（3）固相竞争ELISA

固相竞争ELISA只需将浓缩的、半纯化的灭活全病毒146S作为抗原，检测口蹄疫病毒的抗体。其优点是特异性高、假阳性率低，不足之处是操作繁琐。

（4）夹心ELISA

夹心ELISA方法优点是快速、敏感、准确，在检测田间样品时，敏感性高于补体结合试验。其缺点是实验条件要求高，检测过程需要在特殊的实验室进行。

1.2.3 病毒中和试验

其原理是利用血清中和抗体与口蹄疫病毒发生特异性结合，从而使口蹄疫病毒丧失对易感动物和敏感细胞的感染力。中和试验的优点是既可以鉴定抗原，又可以对血清抗体进行定量测定，缺点是需要培养单层细胞或饲养实验动物。

1.2.4 间接血凝试验

（1）正向间接血凝试验

其原理是将灭活的各型病毒致敏由绵羊红细胞制备的诊断试剂，当其与之相应的血清型的血清反应时即可发生红细胞凝集现象。其优点是试验设备简单、操作简便、灵敏度高，能大规模的检测血清中的抗体。缺点是不同批号的产品效价有波动。

（2）反向间接血凝试验

其原理是将口蹄疫病毒的抗体以化学方法偶联于醛化的绵羊红细胞上，当贴附于血球的抗体与游离的抗原相遇并形成抗原-抗体凝集网络时，绵羊红细胞也随之凝集，出现了肉眼可见的血球凝集现象。其优点是简单、快捷，适合于基层使用，是我国口蹄疫病毒鉴定的行业标准。缺点是检测结果的人为主观性强。

1.2.5 非结构蛋白抗体试验

病毒的非结构蛋白不形成其衣壳蛋白。进行非结构抗体试验时，鉴别诊断的依据是：目前使用的口蹄疫疫苗主要为灭活疫苗或亚单位疫苗，在动物体内不会出现病毒增殖，因此，病毒特异性非结构蛋白（NSP）不能表达产生NSP抗体。而自然感染动物后，则有病毒增殖，有NSP抗体产生。因此，可以利用是否检测到NSP抗体来区分自然感染动物与疫苗免疫动物。目前，我国已经建立了检测3ABC抗体的ELISA方法，并广泛应用干临床检测。

此方法的优点：（1）试剂和样品用量极小，可以低至1～2μl；（2）无需荧光显微镜和酶标检测仪等仪器，非常适合现场使用；（3）没有有害物质（如放射性同位素、邻苯二胺等）的参与；（4）检测时间较短，1～5 min就可以得到结果，并可长期保存；（5）胶体金的敏感性可达到ELISA水平，若结合银染色则检测的敏感性可大大提高。其缺点是免疫层析快速诊断试纸条对疾病的检测属于定性检测，结果只有阴性和阳性，判定结果往往带有主观性。2008年，蒋韬等人通过将纯化的口蹄疫流行株O/ China99、A/AF72、AsiaⅠ/China05 抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上，作为检测带与质控带，组装形成胶体金定型诊断试纸条，能够对口蹄疫病毒进行快速、灵敏、特异的诊断。2009，林彤等人采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记纯化的抗Asia1 型口蹄疫病毒的单克隆抗体，将该标记物与羊抗豚鼠IgG 分别包被在硝酸纤维素膜上，作为检测带和质控带，组装成检测Asia1 型口蹄疫的诊断试纸条，也能快速、灵敏、特异的诊断口蹄疫病毒。

1.3 分子生物学诊断

1.3.1 RT-PCR

RT-PCR的原理是将单链RNA病毒的核酸序列反转录成双链，然后再扩增双链核酸和进行电泳试验，最后通过观察目的条带的大小来进行诊断。该方法利用TaqMan技术，选择3D基因区设计了一组特异的引物和探针，可快速检测O、A、C及Asia I型口蹄疫病毒，且可对病毒进行定量检测，具有高度的特异性和实时性。其优点是耗时较短、敏感性高、特异性强，利于快速、准确地诊断出口蹄疫。缺点是需要提取口蹄疫病毒的RNA，需要在特定的实验室进行检测，不利于现场对口蹄疫进行诊断。2007年，Andrew E. Shaw等人设计出了一步诊断口蹄疫的RT-PCR的方法，相较于两步法，其检测的敏感性有所提高，但当口蹄疫病毒滴度太低时，也不能准确的检测。

1.3.2 荧光定量PCR

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR的关键是使用了荧光探针及其相应的荧光信号检测装置，其检测方法可分为两类：一类是非特异性的双链DNA嵌入染料，如SYBR Green I；另一类是以杂交形式进行的单链检测系统，有水解探针（如Taq-Man）、杂交探针、分子信标、荧光标记引物等。荧光定量PCR的优点：（1）解决了传统PCR方法耗时长、单次检测的样品受限、判定的结果具有主观性等不足；（2）由于实时荧光定量PCR技术有定量检测功能，扩大了传统PCR方法的应用领域。缺点：（1）由于减少了扩增后电泳的检测步骤，因此，不能检测扩增产物的大小；（2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了其复合式检测的应用能力；（3）荧光定量PCR实验成本比较高。

1.3.3 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP的原理与RT-PCR相似之处是，都需要通过扩增目的基因片段，然后对扩增产物进行琼脂糖电泳实验，最后观察产物条带的方法来进行诊断。与RT-PCR相比，LAMP技术具有以下优点：（1）敏感性高。它能从极低微量的拷贝中扩增出目的基因片段，这比传统PCR高出10～1000倍，同时还具有与RT- PCR同样的敏感性。有研究发现，加环引物的敏感性要比没有加环引物的高出7个数量级，即使模板量为0.01 PFu时，也可获得检测结果。（2）特异性好。通过对人流感病毒和人疱疹病毒等病毒的研究结果表明，LAMP不仅能对多血清型的同一病原体进行定型，而且不会出现假阳性结果。（3）简便。由于LAMP是在等温的条件下进行的，所以在进行实验室诊断时，只需要水浴锅或其他等温设备即可，而不需要PCR等实验的昂贵仪器。（4）快速。通常只需要30～60min即可得到检测结果。（5）易于判定试验结果。判定结果时，不需要进行电泳，只需要肉眼观察扩增管的浊度或通过向扩增产物中加入荧光染料观察其颜色变化即可。（6）可与反转录结合，对RNA分子进行扩。

1.3.4 核酸杂交技术

核酸杂交技术是通过将同位素标记的FMDV基因组序列作为探针，然后与口蹄疫基因组RNA特定区域进行反应而建立的检测方法。1998年，Rossi等用P32标记克隆在质粒上的口蹄疫病毒基因组聚合酶序列作为探针，检测感染口蹄疫病毒牛的食道一咽部刮取物即可。其优点是快速、准确。不足之处是要求用活毒进行检测，对实验室要求较高。

2 讨论

酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前检测FMDV感染较为常用的诊断方法，其与间接血凝抑制试验、免疫扩散沉淀试验等检测方法相比，具有灵敏、快速、价廉等优点。口蹄疫检测技术在临床上广泛使用的主要是无生物安全要求的血清学诊断技术，如液相阻断ELISA、非结构蛋白抗体间接ELSIA等。前者主要用于动物疫苗免疫抗体监测，评价疫苗免疫动物抗体水平；后者主要用于FMD感染和人工免疫的鉴别诊断，区分免疫动物和自然感染动物是防治FMD的一项重要工作，通过血清学检测能了解畜群的FMD的免疫抗体合格情况和感染状况。RT-PCR主要是用于口蹄疫疫情爆发时采集组织样品的病原学诊断，并可以区分0型、A型和亚洲I型，对口蹄疫的防控提供重要的技术支撑。