足细胞足突融合的机制及意义

钟永忠　综述　曾彩虹　审校

肾脏的基本功能是将体内的代谢废物排出体外，而肾小球滤过屏障的完整是发挥肾功能的基本保证。滤过屏障由内向外分别由三个部分组成：有孔内皮细胞、肾小球基膜(GBM)及足细胞。足细胞是终末分化细胞，由胞体、初级突起、足突构成，通过足突黏附在GBM上，胞体则漂浮在包囊腔的滤液中，这使足细胞存在以活性细胞从GBM脱离的危险。为了抵抗毛细血管跨膜压，阻止足细胞的脱落，足细胞不但拥有细胞间黏附分子——裂孔隔膜，还存在细胞-基质黏附分子——足突-基膜连接。正常生理状况下，尿液中存在少量足细胞，但在肾小球疾病中，这种脱落的足细胞数量明显增加。足细胞在长期的进化中可能演变出某种机制来抵抗足细胞脱落。在损伤应激过程中，足细胞的形状发生改变，足突融合则是最显著的变化，足突融合是否为足细胞抵抗脱落的机制之一尚存疑问。本文就足细胞-基膜黏附的分子基础及足细胞对损伤所作出的形态结构变化作一简述，着重探讨足突融合的机制及意义。

足细胞-基膜黏附及其信号传导通路

足细胞足突面表达一系列的细胞-基质黏附受体，最重要是整合素α3β1。整合素α3β1是非共价结合的异二聚体，亚基的氨基末端形成胞外配体结合域，与GBM内的层黏连蛋白、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白等结合。整合素胞质侧的尾部较短，它通过相关的衔接分子(如talin、vinculin、paxillin等)将整合素亚基连接到肌动蛋白骨架上。配体与整合素结合后，通过胞质内的激酶[如整合素连接激酶(ILK)、黏附斑激酶(FAK)]将外界的刺激信号传导进入细胞内，诱导足细胞骨架形态及功能改变以应对外界环境的变化。

ILK是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，主要有三个结构域：氨基端的锚蛋白重复序列(ANK)，是ILK与黏着斑蛋白PINCH结合位点。PINCH通过与Nck-2相结合募集肌动蛋白调节蛋白(如WASP、Dock180、PAK)，并进一步通过核化蛋白(Arp2/3、MLC Kinase、confilin等)调节肌动蛋白聚集排列[2]。中间为磷脂酰肌醇结合结构域(PH结构域)，PI3K的产物PIP3与此结构域结合后激活ILK。羧基端为激酶催化结构域，也是整合素及许多actin衔接蛋白的结合区域，包括parvin家族、paxillin等。ILK是 ILK-PINCH-parvin复合物中的核心部分，参与黏着斑复合体及细胞骨架形成，影响细胞运动及迁移。ILK还是整合素与裂孔隔膜上滤过膜分子耦合的桥梁[3]，因此足细胞黏附或者ILK信号的变化都将影响肾小球滤过屏障。

FAK是非受体酪氨酸激酶。FAK肽链的N端是FREM结构域，为细胞因子等受体的结合位点，此区域也能结合和促进整合素介导的非酪氨酸激酶(如Erk)的激活。中段的激酶结构域(PTK)在结合整合素后，Y397位点的酪氨酸自磷酸化，为Scr提供结合位点，Src的结合使FAK得到充分活化。FAK的C端含有黏着斑靶向定位结构域(FAT)，当与整合素结合后，此区域发生聚集，通过与paxinlin及talin结合后招募FAK到黏附处，此区域活化后为多种蛋白的活化提供场所，其中包含P130Cas和GRAF/ASAP1等，这些蛋白可调控Rac和Rho的活性等，并影响α-actinin-4的磷酸化水平与肌动蛋白的解离与聚合[4]。

为了应对外界的机械力，防止足细胞的丢失，细胞基质黏附受体必须与细胞骨架相偶联。足细胞胞体含有三种细胞骨架组分(F-actin、中间丝和微管蛋白)，而肌动蛋白束只在足突表达，并且延伸到细胞细胞连接面和细胞基质连接面[5]，且与整合素黏附相关蛋白复合物介导的黏附功能相偶联[6]。外界机械力可通过细胞表面的整合素引起Rho移位，通过Rho的下游效应器Rho激酶引起细胞骨架的重排。因此，正常生理机制下，Rho的活性受到严格的调控，且抑制Rho激酶可改善许多实验性肾病。

足细胞对损伤的反应

在损伤应激状态下，足细胞形态会发生巨大变化，这些形态变化包括：(1)细胞体的过度肥大(胞质变稀薄和足细胞下间隙扩大形成假性囊肿)；(2)自噬的增加，溶酶体内物质聚集，引起胞质的脱落；(3)足突融合，是最主要的变化；(4)胞质 “微绒毛化”。这些微绒毛既可延伸到GBM，也可延伸到壁层上皮细胞之间的壁层基膜(PBM)。这种现象可解释为足细胞在寻找可以黏附的地方(如GBM或PBM)[7]，之后引起整个足细胞向这个新黏附点迁移。虽然以上这些变化可逆，但也可进展为更加严重的损伤，如细胞凋亡(溶酶体酶释放使细胞溶解)或以活性的细胞从GBM上剥离。

足突融合

病理变化足突融合是指相邻的正常足细胞的趾状结构消失，导致覆盖在GBM上的足细胞足突融合成片，广泛扩张，从而引起肾小球对大分子物质的通透性增加。足突融合的形成包括两个阶段：第一阶段，规律的梳齿状结构消失，足突回缩成短而不规则的细胞突起状结构[8]，同时裂孔隔膜消失或移位，足突之间形成紧密型连接。第二阶段，次级足突向初级足突回缩，导致覆盖在GBM上的足突广泛形成类似于碟状的结构，且最终与胞体融合。此时，正常的足细胞下间隙也大部分消失，足细胞胞体广泛直接黏附于GBM，从而防止足细胞的脱落。

足突融合形成过程中同时伴精密、有序的足细胞骨架的重排。在足突的GBM侧形成细胞骨架丛，这是微丝通过α-actinin连接形成的高度密集有序的网状结构[9]。在各类肾小球疾病都能观察到这种结构，包括微小病变性肾病(MCD)、膜性肾病(MN)和IgA肾病[10]。在大鼠Masugi 肾炎模型中，细胞骨架的重排伴随着actin、α-actinin-4 和synaptopodin表达的增加，同时α-actinin-4主要定位于靠近GBM侧的高密度区域[9]。在氨基核苷嘌呤霉素肾病中，α-actinin-4的表达增加发生在足突融合和蛋白尿之前[11]。足突GBM侧致密微丝的聚集表明足细胞-GBM之间的连接发生了变化，可能增强足细胞与GBM的连接，防止足细胞的脱落。

体外培养的足细胞无足突，予机械应力后，足细胞转换成“运动表型”，类似于体内的足突融合。体内足突融合的早期阶段其实也伴随着迁徙能力的增加，但是足突融合的晚期阶段，足突融合成片，融合的足突区域与GBM紧密结合。体外培养足细胞转换成“运动表型”后，常伴整合素亚型表达的变化，下调整合素α3β1，上调整合素αvβ3，增加足细胞对机械应力的抵抗[12]。糖尿病患者及动物模型中，也同样发现了足细胞中整合素α3β1表达的下调[13]。

功能联系迄今为止，仅少数文献报道足突融合是足细胞的一种适应性反应，而非单一认为是细胞损伤的结果。足突融合时，足突GBM侧细胞骨架内肌动蛋白束成分的增加增强了足细胞收缩能力，以抵抗跨膜压的增加。虽然跨膜压的增加在某种程度上促发了足突融合，但足突融合形成的根本目的并不是为了抵抗跨膜压。

首先，增加的跨膜压影响了整个丝球体，但是足突融合却是局灶分布的。其次，在高血压导致的肾损害模型中[14]，早期缺乏足突融合。相反，高度扩张的毛细血管壁外侧足突非常规律地呈梳齿状分布。因此足突融合的形成必有其他功能上的优点。

足细胞丢失

机体在生理情况下及疾病状态下足细胞丢失的原因和机制一直存在争议。目前认为两种机制参与了足细胞的丢失，即足细胞凋亡和活性足细胞的脱落。

足细胞原位凋亡造成的足细胞丢失在进展性肾小球疾病中，凋亡被广泛认为是足细胞丢失的主要机制。由于体外足细胞并未完全分化，有的明显处于细胞分裂期，并不能完全具备原位足细胞的特点。而体内实验中检测细胞凋亡的方法主要是TUNEL染色法，此方法虽然非常敏感，但也易出现假阳性。即使尿液中发现凋亡的足细胞并不一定意味足细胞在原位发生凋亡，因为足细胞在肾单位内移动过程中失去了与基膜的连接也可导致足细胞凋亡，即失巢凋亡。且尿液在到达缺氧及酸性的膀胱之前可检出活性的足细胞。

肾小球疾病晚期，在包囊腔中偶见少量孤立性的死亡足细胞及细胞碎片，表明足细胞在剥离之前或剥离同时发生了细胞死亡。但这些原位死亡的足细胞是由于胞质内溶酶体酶释放导致细胞溶解而引起的，且相邻的足细胞内也出现溶酶体成分的增加。死亡的足细胞中也未观察到凋亡的典型特点，如凋亡小体的形成[15]。即使足细胞细胞结构发生很大变化，电镜下其细胞核染色质仍保存完好。综上所述，凋亡并不是造成足细胞丢失的主要原因。

活性足细胞剥脱造成的足细胞丢失足细胞的位置与结构使其容易受滤出液剪切力的影响，造成脱落。越来越多的证据表明足细胞可沿GBM迁移，这对足细胞黏附在GBM上提出了巨大的挑战。

尿液中的足细胞肾小球疾病中足细胞的脱落是一个比较常见的病理现象，进一步研究证实这些足细胞大部分仍具有活性[16]，提示凋亡或坏死并非是足细胞脱落的主要原因。足细胞剥离速率和在尿液中出现的多少与疾病的病理进展相关[17]，持续的足细胞数量减少将进展成肾小球硬化。

原位证据研究表明局灶性的足细胞剥离，是部分肾小球疾病足细胞丢失的机制之一[18]。足细胞的完全剥离需经多个步骤才能完成，足细胞部分足突已与GBM剥离时，部分依然固定在GBM上。此时，足细胞形态虽然已存在明显的改变(如足突融合)，但绝大多数足细胞的核膜依然完整，胞质内的细胞器保存完好，提示足细胞依然具有活性。局灶的足突剥离并不意味着整个足细胞将不可逆的从GBM上脱落。因为在某种程度上，足突的局灶剥离是可逆的，如MCD缓解时，足突融合消失，恢复正常的足突结构。

在炎症性动物模型如抗GBM肾炎模型[7]及抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎肾炎模型[19]中，病变明显处的足细胞出现足突融合，但只有节段的足突从GBM上剥离，大部分依然与GBM保持黏连，因此足突融合形成于完全剥离之前。在Thy-1介导的肾小球肾炎模型中[20]，由于系膜基质破坏和系膜细胞损伤，失去对毛细血管袢的支撑，使得尿极处的血管袢突入近端肾小管中。由于此处超滤液流速最快，使足细胞暴露在增强的剪切力中，细胞外形拉长，易发生足细胞脱落。为了应对增强的剪切力，防止细胞脱落，此处的足细胞出现了足突融合。因此，在上述情况下足突融合是足细胞应对机械应力的一种反应，且发于剥离之前。

因此，足突融合似乎代表着一种特殊的、反应性的足细胞表型，它可以增加与GBM的黏合力，至少在一定时间内可降低足细胞剥离的风险。当局部的条件改善后，为重建滤过膜提供基础。

足突融合是对损伤的反应还是原发性损害

要验证足突融合是足细胞防止脱落丢失的一种保护性措施这个假说，必须在不同的肾小球疾病中得到验证。分为两类肾小球疾病：一类是个别肾小球局灶性损伤(至少病变的严重程度不一样)，足突融合被认为是对局灶损伤的一种保护性机制；另一类是所有的肾小球同时受累，此类主要是因为维持正常足细胞结构的相关蛋白网络机制存在原发性缺陷，或因网络中的成分受到异常刺激。

肾小球局灶损伤中的足突融合此类肾小球疾病是累及个别肾小球的节段区域，如炎症性肾小球肾炎，足突融合的出现被认为是足细胞防止脱落的一种保护性机制。足细胞中整合素与肌动蛋白骨架的连接易被补体激活产物及其他有害的炎症介质破坏[21]。在上皮侧免疫复合物沉积的疾病中(如MN、膜增生性肾小球肾炎和狼疮性肾炎等)，免疫复合物的沉积减弱了足细胞与GBM的连接。在糖尿病肾病、Alport 和 Pierson 综合征等疾病时,GBM中基质成分的变化将减弱足细胞与GBM的黏附。在高灌注肾小球疾病中，增加的毛细血管静水压引起GBM张力增加，导致足细胞和GBM之间相互作用的负荷过重,从而使足细胞内肌动蛋白骨架发生反应性变化[22]。在高滤过的疾病中，如糖尿病、妊娠、继发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)等,增加的剪切力在发病机制中起着重要作用[23]，尤其对尿极处的足细胞影响更加明显，形成“顶部病变”或者顶部型FSGS。促进足细胞生长的刺激也会引起足细胞分裂[24]，引起细胞骨架重排，从而影响足细胞与GBM的黏附，但足细胞不能完成胞质分裂，最终导致有丝分裂的“流产”或者双核的出现。

足突融合的形成是这类疾病的共同特征，损伤应激又是如何引起足突融合的呢？可能涉及以下两种机制:(1)机械力的增加影响了足细胞-GBM相互作用，引起整合素介导的由外到里的信号传导。如前所述，此过程涉及整合素、TPV复合物、ILK、和FAK。小鼠ILK过表达会引起足突融合，继而形成FSGS，抑制FAK可减少蛋白尿和足突融合的形成[25]。(2)足细胞剥离早期为节段足突的部分剥脱，这种微小的变化有时在透射电镜中难以辨认，但会影响到裂孔隔膜，改变它的分子结构，同时促发了危险信号导致局部足突融合的形成。而且TRPC通道和小GTPase的Rho家族的信号传导通路在足细胞肌动蛋白骨架调节中的作用也成为研究热点[26]。

足突融合是维持正常结构机制缺陷的结果在许多的遗传性疾病，将足突融合解释为足细胞应对应激的一种保护性反应并不恰当。在这类疾病中，维持足突结构的基因表达发生变化，这些变化或影响了足细胞内的信号传导通路，降低了足细胞对损伤的适应性反应能力，或影响了细胞骨架蛋白的编码从而导致足突融合[27]。因此，在以上情况下，足突融合并不代表对损伤的一种反应，而是直接诱发了足突融合。

MCD在电镜下表现为足细胞足突广泛融合，足突融合的出现是由于循环因子引起细胞骨架蛋白调节异常的结果，而不是对损伤的反应，虽然出现了大范围的足突融合，但无足细胞的丢失及疾病的进展。近年来，suPAR被认为是与FSGS发病相关的一种循环因子，循环中的suPAR与足细胞上的β3类整合素结合后，可激活Rac1和Cdc42信号通路引起足突融合和蛋白尿[28]。

足突融合和蛋白漏出

除了裂孔隔膜，GBM或内皮细胞的损伤也可导致蛋白尿。但蛋白尿的发生与足细胞的结构变化最相关。现有假说一般认为足突融合与蛋白尿之间存在因果关系，且足突融合的宽度与蛋白尿程度相关，但也有文献证实不相关[29]。有学者认为白蛋白以胞吞作用的方式通过融合成片的足突区域形成蛋白尿[35]。但以下解释更具有说服力：如前所述，足突融合是一个多步骤的过程，早期阶段足突在GBM上的移动能力的增强，造成局部短暂的从GBM剥离，可能短暂的引起大分子通过此区域，且在活动性肾小球疾病中，这种短暂的剥离在不同的部位时有发生，因此会出现持续的蛋白尿。

总之，足突融合是足细胞应对损伤的一种保护性机制，阻止足细胞剥离，最终目的是为了限制蛋白的漏出，阻止疾病的进展。在严重疾病状态下，足突融合似乎能够阻止滤过屏障广泛的泄漏，但这也导致滤过率的短暂下降。同时，足突融合并不能完全阻止血浆蛋白的漏出，因为在足突融合形成过程中，裸露的基膜不断增加，导致蛋白的漏出；其次在完全融合区域的边缘，相邻足细胞的异常连接会影响裂孔隔膜的正常功能。

小结：足细胞是终末分化细胞，胞体通过足突黏附在GBM上，周围浸泡在包囊腔的滤过液中。任何破坏足突与GBM连接的损伤都有导致足细胞以活性形式从GBM脱落的危险。在应激状态下足细胞的结构表型发生变化，最显著的变化就是足突融合。足突融合并不是损伤后的病理紊乱，而是细胞为了生存而进化的一种适应性反应。本文认为足突融合是足细胞表型的一种调节性改变，防止足细胞其从GBM上脱落至尿液，甚至以暂时性牺牲滤过率和选择性通透性的方式防止足细胞丢失。

1Sachs N，Claessen N，Aten J，et al.Blood pressure influences end-stage renal disease of Cd151 knockout mice.J Clin Invest，2012，122(1):348-358.

2Millard TH，Sharp SJ，Machesky LM.Signalling to actin assembly via the WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)-family proteins and the Arp2/3 complex.Biochem J，2004，380(Pt 1):1-17.

3Dai C，Stolz DB，Bastacky SI，et al.Essential role of integrin-linked kinase in podocyte biology:Bridging the integrin and slit diaphragm signaling.J Am Soc Nephrol，2006，17(8):2164-2175.

4Schaller MD.Cellular functions of FAK kinases:insight into molecular mechanisms and novel functions.J Cell Sci，2010，123(Pt 7):1007-1013.

5Welsh GI，Saleem MA.The podocyte cytoskeleton--key to a functioning glomerulus in health and disease.Nat Rev Nephrol，2011，8(1):14-21.

6Wehrle-Haller B.Structure and function of focal adhesions.Curr Opin Cell Biol，2012，24(1):116-124.

7Le Hir M，Keller C，Eschmann V，et al.Podocyte bridges between the tuft and Bowman’s capsule:an early event in experimental crescentic glomerulonephritis.J Am Soc Nephrol，2001，12(10):2060-2071.

8George B，Verma R，Soofi AA，et al.Crk1/2-dependent signaling is necessary for podocyte foot process spreading in mouse models of glomerular disease.J Clin Invest，2012，122(2):674-692.

9Shirato I，Sakai T，Kimura K，et al.Cytoskeletal changes in podocytes associated with foot process effacement in Masugi nephritis.Am J Pathol，1996，148(4):1283-1296.

10 Shirato I.Podocyte process effacement in vivo.Microsc Res Tech，2002，57(4):241-246.

11 Smoyer WE，Mundel P，Gupta A，et al.Podocyte alpha-actinin induction precedes foot process effacement in experimental nephrotic syndrome.Am J Physiol，1997，273(1 Pt 2):F150-F157.

12 Dessapt C，Baradez MO，Hayward A，et al.Mechanical forces and TGFbeta1 reduce podocyte adhesion through alpha3beta1 integrin downregulation.Nephrol Dial Transplant，2009，24(9):2645-2655.

13 Chen HC，Chen CA，Guh JY，et al.Altering expression of alpha3beta1 integrin on podocytes of human and rats with diabetes.Life Sci，2000，67(19):2345-2353.

14 Kirchhoff F，Krebs C，Abdulhag UN，et al.Rapid development of severe end-organ damage in C57BL/6 mice by combining DOCA salt and angiotensin II.Kidney Int，2008，73(5):643-650.

15 Peti-Peterdi J，Sipos A.A high-powered view of the filtration barrier.J Am Soc Nephrol，2010，21(11):1835-1841.

16 Vogelmann SU，Nelson WJ，Myers BD，et al.Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.Am J Physiol Renal Physiol，2003，285(1):F40-F48.

17 Fukuda A，Wickman LT，Venkatareddy MP，et al.Angiotensin II-dependent persistent podocyte loss from destabilized glomeruli causes progression of end stage kidney disease.Kidney Int，2012，81(1):40-55.

18 Kemeny E，Mihatsch MJ，Dürmüller U，et al.Podocytes loose their adhesive phenotype in focal segmental glomerulosclerosis.Clin Nephrol.1995 Feb;43(2):71-83.

19 Neumann I，Birck R，Newman M，et al.SCG/Kinjoh mice:a model of ANCA-associated crescentic glomerulonephritis with immune deposits.Kidney Int，2003，64(1):140-148.

20 Friedrich C，Endlich N，Kriz W，et al.Podocytes are sensitive to fluid shear stress in vitro.Am J Physiol Renal Physiol，2006，291(4):F856-F865.

21 Topham PS，Haydar SA，Kuphal R，et al.Complement-mediated injury reversibly disrupts glomerular epithelial cell actin microfilaments and focal adhesions.Kidney Int，1999，55(5):1763-1775.

22 Endlich N，Kress KR，Reiser J，et al.Podocytes respond to mechanical stress in vitro.J Am Soc Nephrol，2001，12(3):413-422.

23 Helal I，Fick-Brosnahan GM，Reed-Gitomer B，et al.Glomerular hyperfiltration:definitions，mechanisms and clinical implications.Nat Rev Nephrol，2012，8(5):293-300.

24 Kriz W，Hähnel B，Rösener S， et al.Long-term treatment of rats with FGF-2 results in focal segmental glomerulosclerosis.Kidney Int，1995，48(5):1435-1450.

25 Ma H，Togawa A，Soda K，et al.Inhibition of podocyte FAK protects against proteinuria and foot process effacement.J Am Soc Nephrol，2010，21(7):1145-1156.

26 Greka A，Mundel P.Cell biology and pathology of podocytes.Annu Rev Physiol，2012，74:299-323.

27 Yaddanapudi S，Altintas MM，Kistler AD，et al.CD2AP in mouse and human podocytes controls a proteolytic program that regulates cytoskeletal structure and cellular survival.J Clin Invest，2011，121(10):3965-3980.

28 Wei C，Möller CC，Altintas MM，et al.Modification of kidney barrier function by the urokinase receptor.Nat Med，2008，14(1):55-63.

29 van den Berg JG，van den Bergh Weerman MA，Assmann KJ，et al.Podocyte foot process effacement is not correlated with the level of proteinuria in human glomerulopathies.Kidney Int，2004，66(5):1901-1906.

30 Kinugasa S，Tojo A，Sakai T，et al.Selective albuminuria via podocyte albumin transport in puromycin nephrotic rats is attenuated by an inhibitor of NADPH oxidase.Kidney Int，2011，80(12):1328-1338.