茄子小孢子培养及其在育种中的应用

范 适, 刘志敏, 连 勇

(1.湖南环境生物职业技术学院园林学院,湖南衡阳421005;2.湖南农业大学园林园艺学院,湖南长沙410128; 3.中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所,北京100081)

茄子小孢子培养及其在育种中的应用

范 适1,3, 刘志敏2, 连 勇3*

(1.湖南环境生物职业技术学院园林学院,湖南衡阳421005;2.湖南农业大学园林园艺学院,湖南长沙410128; 3.中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所,北京100081)

小孢子育种具有能缩短育种周期、便于发现有利隐性突变、能提高选择效率等优点,比常规育种途径有很大的优势.介绍了小孢子培养在育种中的应用、茄子花药培养及小孢子培养的研究进展、相关茄科作物的小孢子培养研究情况及存在的问题与今后的研究方向.参34.

茄子;花药培养;小孢子培养;单倍体;育种

茄子(Solanum melongena L.)属于茄科茄属,起源于亚洲东南部热带地区,以其产量高、供应时间长、营养价值高等特点在我国各地广泛栽培,我国的茄子栽培面积636.862公顷,总产量约1 200万吨,占世界总产量的54.5%,是我国重要的蔬菜作物之一.随着生产的迅速发展,迫切需要新的育种技术的出现,以便以更快的速度育成新的优良品种,而通过小孢子培养获得单倍体的途径,比常规育种途径有很大的优势.

1 小孢子育种的意义

1.1 能缩短育种周期

茄子属常异花作物,天然杂交率为6.67%,一个含有目标性状基因育种材料的纯合需自交5～6代,通常一个新品种的培育需7～8年时间,而利用小孢子培养得到单倍体的方法,则只需2年时间,因而加快了育种亲本的纯合速度,大大缩短了育种周期.

1.2 便于发现有利隐性突变

由于多数突变是隐性,当同源染色体上有显性等位基因存在时,它们不能表现,为了使隐性性状表现出来,需进行反复自交,且出现的机会很低.而在单倍体中,由于只有一套染色体,不受显性等位基因的干扰,因而容易表现出来,且有利突变一经发现,就可通过染色体加倍,得到表现有利突变的可育二倍体.

1.3 能提高选择效率

以自花授粉作物为例,一个杂交组合的二个亲本如有一对等位基因:AA与aa,那么F2植株的基因型及频率为:1/4aa,2/4Aa,1/4AA.但小孢子培养出来的纯合二倍体的基因型及频率是1/2aa,1/2AA.如果我们要选择AA,那么AA在花粉植株中出现的频率(1/2)比在种子繁殖的F2出现的频率(1/4)高一倍.如果两个亲本有n对可自由组合的基因,则在F2中选出我们需要的基因型频率是:1/22n(常规)与1/2n,即花粉植株中选出所需基因型的机会比常规方法高出2n倍.即随n的增大,选择效率也越高.

2 获得单倍体的途径

获得单倍体有三种途径:一是从自然界中寻找,然而这种自然现象产生的频率极低(通常为0.001% ～0.01%)[1].因此未得到广泛应用.二是孤雌生殖途径,即通过培养未受精子房获得单倍体植株.在茄子中至今未见成功的报道.三是通过花药和小孢子培养,这是目前最有效的方法.目前,已在一些蔬菜作物(如大白菜)的育种实践中得到应用[2].

3 茄子花药培养

早在七十年代,我国就对茄子的花药培养进行了研究.文献[3]以北京六叶茄、九叶茄为材料对茄子花药进行离体培养,得到了愈伤组织和胚状体,筛选出适合茄子花药培养的培养基MS,并对激素配比及作用进行了研究,指出萘乙酸与激动素的比例对于诱导根芽分化有重要的作用,其结果还表明,在生长素浓度低的培养基上,易形成胚状体.在此基础上,文献[4]通过花药培养首次获得了单倍体植株,经染色体加倍后获得了较多的纯合二倍体株系,对花粉植株根尖进行染色体鉴定,发现有单倍体、二倍体、三倍体及非整倍体,为克服混倍现象,他们认为通过胚状体直接成苗是有效途径.

然而,花药培养诱导单倍体植株的频率低,能通过花药培养获得再生植株的基因型范围窄,许多有价值的育种材料不能花药培养获得再生植株,以及花药培养时由于药茎和药壁组织的干扰,没有足够的证据来说明再生植株的来源,而且倍性复杂,这些是花药培养一直没有成功地用于新品种选育的主要问题.

4 茄子小孢子培养

小孢子培养是文献[5]在进行曼陀罗花药培养研究的同时创建的.茄科植物小孢子培养起步较早,已在烟草[6]、曼陀罗[7]、矮牵牛[8]等植物上获得了成功.一般认为茄科植物对小孢子培养比较敏感,但是不同的茄科作物的反应相差很大,如烟草的小孢子培养系统已发展得比较完善,作为模式植物广泛应用于雄核发育的各种研究,然而其它茄科作物特别是茄果类蔬菜作物(番茄、甜辣椒、茄子)则很难诱导成苗.如番茄的小孢子培养目前最好的结果仅为文献[9]用四个栽培种及一个野生种进行直接游离小孢子培养时得到的球形胚、类心形胚等胚状体.

对于茄子的小孢子培养,文献[10]报道获得了单倍体植株,在随机选择的12株再生植株中,只有1株为单倍体,7株为自然加倍的二倍体.国内只有文献[11]在小孢子培养前进行四天花药预培养,得到了愈伤组织.到目前为止,还未见其它成功的报道.

影响茄科小孢子培养的因素有以下几个方面:

4.1 基因型

不同基因型在同样的试验条件下,小孢子培养的效率是有差别的.文献[12]对烟草(Nicotinan tabacuum L.)的四个不同基因型的小孢子进行培养,发现供体植株处于同样的栽培环境下,它们之间的胚胎发生能力有明显差异,发生频率变化范围为4.5%～28.7%.文献[13]用栽培番茄的小孢子进行培养,在有的栽培品种中得不到类球形胚.可见基因型的差异在小孢子培养中是普遍存在的.

4.2 供体植株的生长环境

供体植株的栽培环境对小孢子胚胎发生亦有影响,其中温度的影响较大.文献[9]在番茄游离小孢子培养中发现薯叶番茄5月下旬与10月份花蕾的类胚发生率分别为0.01%和0.25,并认为可能是天然的低夜温影响了供体植株体内的小孢子发育方向,使其偏离了配子体方向发育,从而脱分化形成胚状体.在烟草的小孢子培养中,文献[14,15]发现短日照(8 h)及低温(18℃)[16]下生长的供体植株,其小孢子培养效率高;对供体植株施行氮饥饿[17,18]及植物生长调节物质(如 NAA、Alar85)[18]处理,可提高小孢子胚诱导率,文献[14]认为是这些条件改变了供体植株内的营养合成或(和)运转,使发育中的小孢子处于营养饥饿状态,从而偏离了配子体方向的发育而转向孢子体方向发育.

4.3 小孢子发育时期

小孢子所处的发育时期是培养能否成功的因素之一.一般认为茄科植物适用的范围是单核中期至双核中期,但不同的种类的作物其最适时期有所不同,如烟草宜选用单核期小孢子[19],马铃薯用单核末期的小孢子较好[20].如果在小孢子培养前进行花蕾、花药等各种预处理,则要求的小孢子发育时期稍早,因为一般认为小孢子在各种预处理中仍可继续发育[21].

4.4 培养技术

4.4.1 低温预处理

把待分离小孢子的花序、花蕾或花药放在较低的温度下(4℃～10℃)处理一段时间,可提高小孢子胚的诱导率.文献[19]低温处理烟草花蕾后,小孢子分裂指数上升.文献[22]将曼陀罗的花药于4℃下4处理4天,分离出来的小孢子可形成胚,而未经处理的小孢子则不反应.文献[9]在番茄游离小孢子培养中发现,即使供体植株处于低温环境下,小孢子类胚发生率提高.由此推测低温预处理对茄科植物的小孢子脱分化诱导是有效的.

4.4.2 高温预处理(或热激处理)

小孢子经过分离纯化后,在正常温度下培养之前,先放在高于正常培养温度下培养一段时间的处理,称为高温预处理,亦为热激[23].文献[10]在对茄子进行直接游离小孢子培养时,认为蔗糖饥饿与热激两个处理对于愈伤的诱导是必不可少的,在35℃高温时,愈伤的诱导率最高,而在培养温度25℃时却几乎没有愈伤的形成.文献[24]33℃热激处理烟草小孢子2天可提高小孢子胚诱导率.在芸苔属的小孢子培养中也得到了类似的结果,文献[25]在油菜中摸索到了在通过高温和低温来控制小孢子的发育命运,他们的结果显示,预处理期间32.5℃高温热激处理2天可使小孢子朝胚胎发生途径并进而形成胚,17.5℃低温2天则导致小孢子朝配子体成熟的途径发育.文献[26]的研究表明, 33℃热激处理24～72小时是诱导小白菜小孢子胚胎发生的必要条件.

4.4.3 营养饥饿

营养饥饿对于烟草小孢子胚的诱导似乎是必需的,文献[27-28]报道烟草小孢子培养前在蒸馏水中处理几天,能诱导小孢子脱分化的启动.文献[29]成功地运用谷氨酰胺的添加来控制烟草离体小孢子的发育方向,在含有谷氨酰胺的培养基上培养,小孢子朝孢子体方向发育,反之,则朝配子体方向发育.文献[10,24]在烟草和茄子的小孢子培养中认为,在小孢子培养之前的短时期营养饥饿处理对小孢子脱分化是必需的.文献[15]推测,一些环境条件(如短日照(8 h)、低温(18℃)[16]、氮饥饿[17,18]、生长调长物质处理:NAA[18]对供体植株的影响可能是因为这些条件妨碍了供体植株营养物质的合成和转运,从而引起供体植株处于营养饥饿状态,导致小孢子偏离了配子体发育方向.由此推测营养饥饿处理对于茄科植物小孢子脱分化的启动是有效的.

在目前大多数成功的例子中,似乎只有在小孢子培养前经过各种处理(如低温、热激、营养饥饿等)才能启动小孢子脱分化并进而发育成植株.在小孢子脱分化启动机理方面,科学家作了许多有益的探索.文献[24]认为,热激及其它些物理、化学方面的胁迫处理可能在小孢子内部产生了同样(或重叠)的效果,如产生一些特定的热激蛋白(HSPs).文献[30]在小孢子培养前热激处理,得到了一些特异性mRNA和蛋白质,并指出一些蛋白质可能是热激蛋白(HSPs).文献[31]在烟草小孢子培养前应用营养饥饿处理也得到了相似的结果.

4.5 培养基

茄科作物小孢子培养常用的培养基有Nitsch、MS、White和B5.

培养基中的糖类、植物激素、添加物等对小孢子培养的结果有影响.文献[32]认为小孢子培养对蔗糖的要求十分专一,不能用代谢不活泼的化合物或其它双糖代替.文献[29]研究发现半乳糖可以诱使烟草花粉分裂,但若缺乏蔗糖,这些分裂的花粉则不能进一步发育分化.茄科作物小孢子培养所要求的蔗糖浓度较低,一般为2%～4%.对于植物激素的作用有些争议,一般认为低浓度的生长素类物质可提高胚状体的诱导频率,而高浓度则易产生愈伤组织和使细胞倍性复杂化[33].在培养基中添加活性碳,对于小孢子培养是有益的,能提高小孢子胚的诱导率[2],因为它能够吸附培养基中的抑制物质以及琼脂中的杂质,但也能吸收有益物质如Fe-EDTA,添加性碳虽然提高了胚的发生率,但是不正常胚的数目增多[34].

5 前景与展望

小孢子培养较花药培养有许多优越性:第一,它排除了药壁组织的干扰,产生的胚及再生植株都可靠地来自小孢子群体;第二,能在较宽的基因型范围内以高的诱导率获得小孢子胚和再生植株.第三,小孢子植株还具有自然加倍成为二倍体的特点.因此,游离小孢子培养在遗传育种研究方面具有十分诱人的应用前景.

但在应用中仍存在一些问题,如胚状体或愈伤组织的诱导率低,成苗难.由于基因型的差异也使许多优良的单株或品系不能快速通过单倍体的途径应用于育种中.在理论上,由于小孢子脱分化启动机理尚处于猜测、探讨阶段,在实际工作中造成很大的局限性.为加强这种技术在育种中的应用,需在小孢子的诱导机制、启动机理、遗传因素等方面作深入的研究,以使小孢子培养技术在育种中挥更大的作用.

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Research Progress in Breeding of Eggplant M icrospore Culture

FAN Shi1,3, LIU Zhi-m in2, LIAN Yong3

(1.Lanedscape Department,Hunan Enviromen-Biological Polytechnic,Hengyang 421005,China;2.Horticulture and Landscape College,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China;3.The Institute of Vegetable and Flowers,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Beijing 10081,China)

Microspore breeding can short the breeding cycle,find favourable recessive mutation,improve the selection efficiency.It hasmore advantages than the conventional breedingmethods.This paper introduces the application ofmicrospore culture in breeding,the research progress of anther culture and microspore culture of eggplant.This paper points out the existing problems,puts forward the research direction in the future.34refs.

Eggplant;anther culture;microspore culture;haploid;breeding

文献标识码:

2014-12-23

中国农业科学研究院与欧盟合作研究项目,农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目

范 适(1969-),男,湖南衡阳人,博士,副教授,研究方向:植物组织培养.

*通讯作者,E-mail:lianyong@caas.cn