浅析埃博拉病毒致病机制

盛子洋 范东瀛 安 静

(首都医科大学基础医学院微生物学教研室，北京100069)

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)属于丝状病毒科(Filoviridae)埃博拉病毒属(Ebolavirus)的单股负链RNA病毒，其基因组共编码7种蛋白，包括核蛋白NP、病毒粒子结构蛋白 VP35、VP30、糖蛋白 GP、基质空间蛋白VP40、VP24和RNA-dependent RNA聚合酶(L)［1］。EBOV分5个种，根据其最初被发现的地点分别命名为扎伊尔埃博拉病毒(Zaire Ebolavirus，ZEBOV)、苏丹埃博拉病毒(Sudan Ebolavirus，SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒(Taï Forest Ebolavirus，TAFV)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo Ebolavirus，BDBV)和雷斯顿埃博拉病毒(Reston Ebolavirus，RESTV)。EBOV感染可引起严重甚至致命的出血热疾病，但种间的致病力和致死率不同，扎伊尔种、苏丹种、本迪布焦种都曾在非洲大陆引发过较大规模的疫情，其中扎伊尔种致死率高达90%［2］。

人体感染EBOV后，若患者未能及时建立有效的免疫应答，则可在2-21 d的潜伏期后出现埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD，也称埃博拉病毒性出血热，EHF)［2］。早期症状类似流感，包括发热、疲劳、头痛、肌痛、恶心、呕吐、腹泻等。随着疾病的进展，体内外可呈现出血症状，包括皮下、脏器、消化道出血等。与其他出血热病毒(马尔堡病毒、拉萨热)感染者相似，EVD患者还可能出现记忆力减退、中枢神经系统紊乱、大量脱发等症状。该病预后极差，约50%的患者可能死于弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)、感染性休克及多器官衰竭综合征(multiple organ failure syndrome，MODS)等。尽管目前EVD的临床经过相对明确，然而由于取材困难、疫情暴发地区偏远、研究条件要求高等原因，EBOV的致病机制尚不清楚［3］。EVD的临床特点以出血为主，因此，EBOV致出血机制是研究者关注的重点。

在EVD患者及/或感染动物模型体内可以观察到两大类病理改变，一是宿主针对病毒的免疫应答引起的免疫病理学改变，二是病毒对宿主结缔组织与细胞产生的病变。二者互为因果，协同作用，被认为是病毒致病的重要机制。

为研究EBOV的感染机制，学者们利用猪、恒河猴、猕猴等动物模型探寻EBOV的靶细胞［45］。研究者发现病毒进入体内后，首先感染单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞(淋巴组织内网状细胞及肝内枯否细胞)，这些细胞能够支持病毒的复制，并且是病毒持续攻击的对象;随之受累的是肝和肾上腺的实质细胞和内皮细胞;最终感染上皮细胞［45］。病毒在宿主细胞内复制，其组分及病毒颗粒以囊泡(vacuoles)的形式存在，成熟后以出芽的形式释放，这一过程有助于病毒逃避宿主的免疫监视［6］。

研究表明［7-8］，EVD的发生与机体受到感染后的免疫应答水平密切相关。研究人员利用最致命的ZEBOV进行体外实验及动物实验，结果显示机体在感染后出现高水平的病毒血症，产生大量的促炎性细胞因子和趋化因子，并有淋巴细胞凋亡和广泛的组织破坏等现象，这些最终导致内皮细胞损伤和MODS。

以人类EBOV感染者样本为实验材料的研究寥寥可数。在1999年的一篇报道中，学者们［9］收集了1995年在刚果金被ZEBOV感染后2名幸存者与7名死亡者的血液样本，比较血清中细胞因子水平发现，死亡者的体内存在细胞因子风暴的现象，包括白介素-2(interleukin-2，IL-2)、IL-10、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素 γ (interferonγ，IFN-γ)和 IFN-α在内的细胞因子水平均显著升高，因此作者认为疾病晚期免疫系统的过度活化可能是重要的死亡原因。另有研究［10］显示疾病晚期的细胞因子风暴是疾病早期机体的免疫应答缺如导致的，后者是病毒致死的根本原因。该研究小组收集了1996年加蓬地区两起EVD疫情中ZEBOV感染后8名幸存者与9名死亡者的血液样本(以12例疫区未感染者血清为对照)，对比研究急性期和恢复期的细胞因子水平后发现，在感染早期，幸存者体内包括IL-1b、TNF-α、IL-6、巨噬细胞炎性反应蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)1a和MIP-1b在内的细胞因子水平显著上升，而恢复期这些细胞因子的水平下降。与之相反，死亡者体内细胞因子水平在急性期升高不明显，而疾病晚期则明显增加。这些细胞因子均有促进炎性反应的作用，因此，作者认为感染初期适当的炎性反应有助于机体限制病毒的复制和扩散，降低患者的病死率。据此作者指出，细胞因子表达量的差异可以作为患者预后的评估指标，急性期高水平的IL-6和IL-1b预示着良好的疾病转归，而IL-1受体拮抗蛋白(IL-1receptor antagonist protein，IL-1RA)或新喋呤的升高则可能预后不良，若患者体内IL-10持续高表达，则预后极差。一篇发表于2010年的文献［8］，通过更大的样本量对感染后人体内免疫状态、免疫反应强度与疾病的关系进行了分析，作者收集1996～2003年间加蓬及刚果布地区五起疫情中的56例ZEBOV感染者的血液标本，包括14幸存者与42例死亡者，且以30例疫区未感染者血清为对照，通过对循环血中细胞因子、趋化因子、生长因子的检测以及T淋巴细胞总量及亚型的研究发现，EVD的重要死亡原因是疾病早期固有免疫和适应性免疫处于抑制状态，而疾病晚期出现异常的细胞因子风暴，最终出现休克、MODS等并发症。SEBOV感染也可在体内造成持续的炎性反应［11］。这一结论与之前研究的观点是一致的。

关于EBOV引起免疫抑制，可能是多途径调控的结果。EBOV进入体内后，首先感染单核巨噬细胞及树突状细胞，被感染的树突状细胞成熟受到抑制，从而使机体无法激发T细胞免疫应答［12］;另外，EBOV本身虽不感染T淋巴细胞，却可以通过Fas/FasL途径导致T淋巴细胞的凋亡［8］。特别值得关注的是病毒蛋白对机体免疫功能的影响。例如，VP35蛋白上有多个固有免疫拮抗域(innate response antagonist domains，IRADs)，其协同作用可抑制树突状细胞的成熟，任何一个IRAD的丢失突变，病毒则会失去该作用［12］;VP35蛋白能够抑制人干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)的活化，从而抑制 IFN-α/β的合成，这一作用与病毒的毒力密切相关［13］，VP35还可与VP24蛋白联合作用，通过下调人IRF的表达而抑制多条干扰素信号通路，进而抑制宿主细胞的固有抗病毒反应［14-16］。综上，感染通过多种机制破坏了固有免疫和适应性免疫的功能，使得机体处于免疫抑制状态，不能限制病毒在体内的复制和播散，病毒入血后大量复制形成高病毒血症，导致机体出现细胞因子风暴，最终致死。炎性反应过程可以控制的病毒复制和诱导特异性免疫应答，因而是固有免疫和特异性免疫的关键因素。若机体在感染初期能够诱导产生炎性反应，及时清除病毒，则患者可能幸存。所以感染初期免疫水平与病毒感染的严重程度密切相关，是决定疾病转归的重要因素。

EVD的另一病理改变即结缔组织出血。EBOV感染引起的出血大都是由于血管通透性增加而发生的渗出性出血。其机制可能有:①EBOV具有泛嗜细胞性，多种组织细胞均可被感染，因而器官受损。临床研究证明，EVD患者肝、肾受累最重。肝脏是凝血因子一个重要来源，肝脏受损直接导致凝血因子合成下降。另外，体外试验也证明病毒感染肝细胞可下调凝血相关产物的表达，说明病毒致肝脏损害，凝血因子合成减少是EBOV感染后出血的重要原因之一［17］;②细胞因子风暴及其引发的一氧化氮的大量释放，均可直接改变内皮细胞形态和功能，甚至破坏血管，增加血管通透性。细胞因子中，TNF-α可通过多个机制促进血管通透性增加［18］，它可通过与特定的内皮细胞受体结合，激活内皮细胞，进而增加内皮细胞的通透性［19］;TNF-α还可降低内皮细胞的抗凝活性、上调表达白细胞、血小板的黏附分子等，从而促进出血的发生［6］。通过对猕猴实验模型的观察也显示，在EBOV感染导致的凝血障碍机制中，免疫病理反应介导的内皮细胞功能障碍可能占重要地位，细胞因子风暴刺激组织因子的表达［17］，启动凝血级联反应，最终导致DIC［6］;③多项研究显示，病毒能够直接破坏血管内皮细胞，这在 EVD发生过程起着至关重要的作用［3］，其重要机制之一是GP蛋白可直接与内皮细胞结合导致内皮细胞的表面分子下调表达、附着力下降，严重者内皮细胞死亡，以上病理变化均可导致血管通透性增加，引起出血［20］;另外，实验［21］表明EBOV的GP1，2蛋白与巨噬细胞结合，随之启动细胞信号通路，影响宿主细胞基因，特别是炎性反应因子相关基因的表达水平，后者在调控感染后机体免疫应答强度的同时，也影响内皮细胞的功能和通透性，进而成为出血的另一重要原因。

综上，人体感染EBOV后，机体免疫状态的改变以及宿主细胞的形态和功能变化密切相关，两者互为因果，相互影响，决定疾病的预后。机体免疫状态过度激活和细胞因子风暴可以使宿主细胞受累，而宿主细胞的损伤又可以引发进一步的细胞因子风暴。这种多细胞、多因子、多个信号通路参与的致病机制给治疗带来了诸多困难，故目前针对EVD的治疗仍以支持治疗及对症治疗为主，缺乏有效的、特异性抗病毒手段。相信随着医学的进步和研究的深入，阐明EBOV致病机制、找到高效安全的预防和治疗方法应该为期不远。

［1］ Leroy E M，Baize S，Volchkov V E，et al.Human asymptomatic Ebola infection and strong inflammatory response［J］.Lancet，2000，355(9222):2210-2215.

［2］ WHO.Ebola virus disease;Fact sheet N°103. ［EB/OL］［2014-09-10］.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs103/en/.).

［3］ Sullivan N，Yang Z Y，Nabel G J.Ebola virus pathogenesis:implications for vaccines and therapies［J］.J virology，2003，77(18):9733-9737.

［4］ Geisbert T W，Hensley L E，Larsen T，et al.Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques:evidence that dendritic cells are early and sustained targets of infection［J］.Am J Pathol，2003，163(6):2347-2370.

［5］ Davis K J，Anderson A O，Geisbert T W，et al.Pathology of experimental Ebola virus infection in African green monkeys［J］.Involvement of fibroblastic reticular cells.Arch Pathol Labo Med，1997，121(8):805-819.

［6］ Feldmann H，Bugany H，Mahner F，et al.Filovirus-induced endothelial leakage triggered by infected monocytes/macrophages［J］.J Virology，1996，70(4):2208-2214.

［7］ Geisbert T W，Young H A，Jahrling P B，et al.Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in primate models:evidence that hemorrhage is not a direct effect of virus-induced cytolysis of endothelial cells［J］.Am J Pathol，2003，163(6):2371-2382.

［8］ Wauquier N，Becquart P，Padilla C，et al.Human fatal zaire ebola virus infection is associated with an aberrant innate immunity and with massive lymphocyte apoptosis［J］.PLoS neglected trop Dis，2010，4(10):e837.

［9］ Villinger F，Rollin P E，Brar S S，et al.Markedly elevated levels of interferon(IFN)-gamma，IFN-alpha，interleukin(IL)-2，IL-10，and tumor necrosis factor-alpha associated with fatal Ebola virus infection［J］.J Infect Dis，1999，179 Suppl 1:S188-191.

［10］ Baize S，Leroy E M，Georges A J，et al.Inflammatory responses in Ebola virus-infected patients［J］.Clin Exp Immunol，2002，128(1):163-168.

［11］ Sobarzo A，Ochayon D E，Lutwama J J，et al.Persistent immune responses after Ebola virus infection［J］.N Eng J Med，2013，369(5):492-493.

［12］ Lubaki N M，Ilinykh P，Pietzsch C，et al.The lack of maturation of Ebola virus-infected dendritic cells results from the cooperative effect of at least two viral domains［J］.J virology，2013，87(13):7471-7485.

［13］Hartman A L，Bird B H，Towner J S，et al.Inhibition of IRF-3 activation by VP35 is critical for the high level of virulence of ebola virus［J］.J virology，2008，82(6):2699-2704.

［14］ Basler C F，Mikulasova A，Martinez-Sobrido L，et al.The Ebola virus VP35 protein inhibits activation of interferon regulatory factor 3［J］.J virology，2003，77(14):7945-7956.

［15］Mateo M，Reid S P，Leung L W，et al.Ebolavirus VP24 binding to karyopherins is required for inhibition of interferon signaling［J］.J virology，2010，84(2):1169-1175.

［16］Feng Z，Cerveny M，Yan Z，et al.The VP35 protein of Ebola virus inhibits the antiviral effect mediated by doublestranded RNA-dependent protein kinase PKR［J］.J virology，2007，81(1):182-192.

［17］Kash J C，Muhlberger E，Carter V，et al.Global suppression of the host antiviral response by Ebola and Marburgviruses:increased antagonism of the type I interferon response is associated with enhanced virulence［J］.J virology，2006，80(6):3009-3020.

［18］ Horvath C J，Ferro T J，Jesmok G，et al.Recombinant tumor necrosis factor increases pulmonary vascular permeability independent of neutrophils［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1988，85(23):9219-9223.

［19］ Nawroth P P，Bank I，Handley D，et al.Tumor necrosis factor/cachectin interacts with endothelial cell receptors to induce release of interleukin 1［J］.J Exp Med，1986，163(6):1363-1375.

［20］ Yang Z Y，Duckers H J，Sullivan N J，et al.Identification of the Ebola virus glycoprotein as the main viral determinant of vascular cell cytotoxicity and injury［J］.Nature medicine，2000，6(8):886-889.

［21］Wahl-Jensen V，Kurz S，Feldmann F，et al.Ebola virion attachment and entry into human macrophages profoundly effects early cellular gene expression［J］.PLoS Neglected Trop Dis，2011，5(10):e1359.