非酒精性脂肪性肝病与肠道菌群失调新观点

孙露综述，鲁晓岚审校

非酒精性脂肪性肝病与肠道菌群失调新观点

孙露综述，鲁晓岚审校

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在世界范围内患病率逐渐升高，“二次打击学说”发病机制已经被认可，但是具体的病理生理学发病机制还不完全清楚。近期，已有大量研究的新观点来解释肠道菌群在NAFLD发病机制中的作用，包括调节肠粘膜通透性、低水平炎症反应和免疫平衡，调节饮食胆碱代谢，调节胆汁酸代谢和增加细菌产生的内源性乙醇等。这些因素在分子水平上解释了肠道菌群如何促发NAFLD的发生，并进一步诱导其向非酒精性脂肪性肝炎（NASH）进展。

非酒精性脂肪性肝病；肠道菌群；脂多糖

肠道菌群是一个巨大的体内代谢器官，大约由1014种微生物组成，是人类基因的100～400倍。相关数据表明肠道菌群对健康有重要影响，其产生的酶类大约有35%可为人体所利用，形成共有营养、协同免疫、促进生长代谢和生物拮抗等作用。最近有研究证明肠道菌群在相关代谢性疾病（如胰岛素抵抗和2型糖尿病）的进展中起到直接作用，例如发现肥胖患者与瘦人相比，肠道内含拟杆菌较少而厚壁菌较多，且肠道菌群直接影响肠道内容物中热量的获得比率和脂肪的储存[1]。本文就最近肠道菌群在非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD）患者中的组成和病理生理学发病机制进展进行综述，着重表述脂肪肝和肠道菌群间有待论证的分子机制。

1 NAFLD的发病机制

NAFLD是一种很常见的疾病，在普通人群中的发病率为16%～30%，而在肥胖患者中的发病率达到50%～90%，其中有多于1/3的人表现为NASH。NAFLD的诊断依赖于组织学，表现为一个广泛的疾病谱病变，从脂肪变性开始，即肝细胞中甘油三酯聚积而没有其他肝脏疾病和酒精摄入。一些患者也会发展到肝细胞损伤，比如气球样变和炎症浸润，称为NASH；伴或不伴胶原纤维沉积（纤维化）进而导致肝硬化，严重时可导致肝癌。

关于NAFLD的发病机制，“二次打击”学说被提出来解释肝脏改变分期的进程，第一次打击主要因为肥胖和胰岛素抵抗肝细胞脂肪沉积，第二次打击只在部分病人中出现，使得脂肪变性向NASH转变。一些因素参与NAFLD的病理生理学发病机制，包括氧化应激、系统炎症介质和慢性间断性缺氧。最近研究表明因为在大多数患者中肝脏单纯脂肪变性是一个良性过程，NASH可能是一个有着不同的发病机制的独立疾病，许多打击特别是肠道和脂肪组织产生的因子可能与肝脏炎症独立相关并最终致病[2]。

也有相关数据表明NAFLD与心血管疾病患病增加有关，一些小样本研究发现NAFLD不仅能够独立于其他普通的危险因素和代谢综合征的其他组分而增加心血管疾病的风险[3]，而且能增加相关疾病的死亡率[4]。然而至今还没有肯定有效的方法缓解NASH，因此寻找新的NASH发病机制例如肠道菌群，可以为预防及发现新的治疗靶点指出新的研究方向。

2 肠道菌群在NAFLD发病机制中的作用

一些证据表明肠道菌群和肝脏之间存在密切的联系。从解剖结构上看，肝脏通过门静脉收纳肠道70%的血液，所以它既是抵抗肠道来源抗原的第一道屏障也是暴露于肠源性毒素最多的器官，比如肠道细菌和细菌产物。在动物和人体实验中肠道菌群和NAFLD进展之间的关系都有体现。Backhed et al人在实验中发现给无菌小鼠体内植入普通小鼠的结直肠菌群，15天后其中60%出现身体脂肪增加且肝脏甘油三酯的含量增加两倍以上[5]。也有研究发现在小肠旁路术后患者NASH病情进展与小肠细菌过度生长之间存在平行关系，并且服用抗生素（甲硝唑）后肝脏脂肪变性减轻[6]，表明肠道菌群在NAFLD中的始动作用。

总结近年来新的研究发现，肠道菌群增加肝脏脂肪沉积和促进NASH进程的机制为：通过从食物中摄取更多能量导致肥胖；调节肠粘膜通透性、低水平炎症反应和免疫平衡；调节饮食胆碱代谢；调节胆汁酸代谢；增加细菌产生的内源性乙醇。

2.1 LPS和Toll样受体-4（toll-like receptor-4，TLR-4）信号通路许多动物模型发现LPS–TLR-4信号活化与胰岛素抵抗和NASH密切相关。Cani et al人首先发现喂养小鼠4周高脂饮食是怎样导致其血浆中LPS浓度轻度升高，并定义其为“代谢性内毒素血症”，因为这种升高比败血症引起的内毒素血症低10～50倍[7]；且给小鼠输注4周LPS后其表现与喂养高脂饮食相似，即胰岛素抵抗增加、肝脏甘油三酯增多和脂肪组织炎症反应。关于TLR-4缺失小鼠的研究也证实TLR-4是肝脏脂肪沉积和NASH进展的必要因素[8]。肝脏星形细胞在内毒素相关的引起肝脏炎症级联反应中也起到重要作用，因为它被证明是TLR-4通过转化生长因子(TGF-β）信号途径促使纤维化的靶点[9]。

细菌和宿主在肠道粘膜的相互作用是固有免疫和获得性免疫反应保护宿主和维持肠道稳态的原因，NAFLD和其它胰岛素抵抗状态都与固有免疫激活相关，而肠道菌群参与整个宿主免疫的发展和稳态[10]。这需要特殊的识别受体，包括Toll样受体和NOD样受体，它们可以识别高度保守的细菌分子即病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs），而内生性产物是由损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）的形式识别。TLRs传递PAMPs和DAMPs、启动固有免疫反应、通过信号级联反应导致促谈因子活化，例如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素-6（interleukin，IL-6），IL-8，IL-12[11]。PAMP中研究最多的是LPS，它是格兰阴性细菌细胞膜的主要成分、是内毒素的活性成分。后者通过与脂多糖绑定蛋白（Lipopolysaccharide binding protein，LBP）结合，再与CD14结合，形成LPS–LBP–CD14复合物激活TLR-4，呈递给Kupffer细胞（肝内的巨噬细胞），启动必要的炎症级联反应，包括应激活化的和分裂素活化的蛋白激酶、JNK途径、p38、干扰素调控因子3和核转录因子-κB（NF-κB）途径[12]，NF-κB向细胞核移位又会导致TNF-α和IL-1β等许多因子的基因活化，其他细菌内毒素比如肽聚糖也可通过NOD1受体有助于激活促炎因子级联反应[13]。人体研究发现患NASH成人和儿童内毒素水平增高，且内毒素增高水平与疾病的严重程度相关[14]。这说明慢性内毒素血症是一种“肝毒素”，在诱导肝脏炎症、纤维化和胰岛素抵抗中起到非常重要的作用。

2.2 肠粘膜通透性改变和小肠细菌过度生长肠道上皮细胞起到介导肠道菌群和宿主免疫系统的核心作用，肠道上皮细胞之间的紧密连接起到保持肠粘膜完整的重要作用。已有研究证明NASH与小肠细菌过度生长和肠粘膜通透性增高相关，Miele 等人首先提出在通过肝组织活检证实35名NAFLD患者体内肠粘膜通透性增高和紧密连接改变，并且肠粘膜通透性和小肠细菌过度生长的患病率与脂肪变性的严重程度相关[15]。Wigg et al人发现有50%的NASH患者存在小肠细菌过度生长，而在对照组中只有22%[16]。最近Gabele等人发现了受损的肠道屏障与肝脏纤维化和炎症之间的新观点[17]。他们给C57BL/6小鼠喂食高脂饮食制造NASH模型，然后将它们暴露于1%的右旋硫酸钠（这样的暴露会导致肠道上皮细胞受损）中观察结果。发现结合了高脂饮食和右旋硫酸钠组的小鼠不仅仅脂肪性肝炎加重了，还能诱导肝脏产生纤维化。这些结果都表明打破细菌和宿主间在肠道粘膜水平的稳态不仅能导致肠道屏障改变，还能促使肠道菌群向肝脏循环中移位进而造成肝损伤[18]。然而，移位菌群的性质和种类还需研究。

2.3 胆碱代谢改变胆碱是一种重要的细胞膜的磷脂组成成分，也是肝脏脂肪代谢中关键成分，由极低量的脂蛋白装配而成。胆碱缺乏饮食会导致肝脏脂肪变性，这是因为胆碱的输注是可逆的。细菌的代谢产物可以催化饮食中胆碱向毒性代谢产物（二甲胺和三甲胺）转变，肝脏摄入这些胺类并且将它们转变为三甲胺-N-氧化物会导致肝脏炎症[19]。Volynets 等人发现在胆碱缺乏时人类粪便中变形菌的水平和肝脏中脂肪改变直接相关[20]，这说明肠道菌群失调可以通过降低胆碱和增加毒性甲胺类的水平促进NASH进展[21]。

2.4 调节胆汁酸代谢胆汁酸是胆汁的主要组成成分，分泌进入十二指肠起到乳化脂溶性营养物质促进其消化和吸收的作用。胆汁酸也有较强的抗菌活性，可通过与细胞膜的磷脂作用损伤细菌细胞膜[22]。最近有研究发现饮食中的脂肪（尤其是饱和脂肪）通过使宿主胆汁酸的成分改变，可以显著地改变肠道菌群的组成并导致失调[23]。胆汁酸是G-蛋白偶联受体（TGR5/Gpbar-1）的配体，也能激活核受体比如FXR（NR1H4）。所以肠道菌群也可通过FXR（farsenoid X receptor）调节胆汁酸代谢。Dekaney等人发现与野生型小鼠相比，回盲部切除后的小鼠FXR无效并且无菌小鼠不能表达调控胆汁酸转运的基因[24]。FXR和它的下游靶点在调控肝脏脂质新生、极低密度脂蛋白甘油三酯输出和血浆甘油三酯转化中起到关键作用[25]，还可通过刺激胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的分泌及绑定TGR5刺激胆汁酸进而促进血糖稳态[26]；使用TGR5激动剂同样能降低血浆和肝脏甘油三酯水平从而减轻肝脏脂肪变性[27]。因此通过调节胆汁酸代谢和FXR/TGR5信号传导，肠道菌群可以直接促进NAFLD的进程[28]。2.5细菌代谢产生的肝毒性物质-乙醇细菌代谢产生许多潜在肝毒性产物比如乙醇、酚类、氨类，这些都通过门静脉循环进入肝脏，激活Kupffer细胞并且刺激其产生含氮的氧化物和细胞因子。乙醛和乙酸是乙醇最主要的两种代谢产物。然而乙酸是脂肪合成的底物，乙醛可以导致活性氧自由基（reactive oxide species，ROS）的形成，其都被包括在肠道屏障功能破坏导致肝脏损伤和NASH的“二次打击”机制中。Zhu et al人研究合并NASH和不合并NASH的肥胖患者和健康儿童，发现在没有酒精摄入的情况下NASH儿童的肠道菌群中产生酒精的细菌增加、血中乙醇浓度增加[29]。他们还发现大肠埃希菌（产乙醇的主要细菌）是NASH患者和不合并NASH的肥胖患者间主要不同的菌种。内生性乙醇在ROS的产生并导致肝脏炎症的作用已被确认，这也参与了肠道粘膜通透性增加[30]。

3 NAFLD治疗的新靶点-调节肠道菌群

益生菌是活的共生微生物，其数量繁多，对宿主健康起到有益作用。益生菌已经被证明是一种保护慢性肝脏损伤的治疗方法，因为其能阻止细菌移位和侵入上皮细胞、抑制细菌粘附粘膜表面、产生抗菌多肽、降低炎症反应和增强宿主免疫。市面上最主要的益生菌是乳酸杆菌、链球菌和双歧杆菌，虽然这方面的文献是大规模的，仍然很难得出益生菌对NAFLD的真实作用。因为不同的动物模型和细菌菌株检验研究是不同的，肠道菌群的数目总是超过可调控的益生菌的数目，并且益生菌实验总会受到人类微生物基因组、饮食和遗传性的干扰。一些动物实验证明益生菌能减缓NASH的进展，最常研究的是VSL#3混合物。首先给肥胖小鼠喂养4周高脂饮食，再用VSL#3治疗，发现肝脏组织学病变改善、肝脏脂肪酸含量降低、血清转氨酶水平降低[31]。Ma 等人发现VSL#3能通过阻止高脂饮食引起的自然杀伤T细胞消耗，从而减轻胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性[32]。乳酸杆菌对NAFLD有一定的保护作用，然而最进一项Meta分析指出特定菌种（L.酵母菌）与体重增加相关[33]。益生菌有一些抗炎效果，可使NAFLD获得临床益处。人体实验初步数据得出NAFLD患者口服VSL#3 2～3个月，肝脏酶、TNF-α和氧化应激指标都有所好转[34]。近期一项随机双盲对照试验表明儿童和成人服用益生菌后肝脏转氨酶都明显下降[35]，这些结果都能很好的证明使用益生菌治疗NAFLD的潜在有益作用。然而，益生菌的作用还需要多因素Meta分析和大规模随机试验结果来证明。

益生元是不可消化但可刺激有益菌（特别是乳酸杆菌和双歧杆菌）的生长和活性的碳水化合物。乳果糖是常用的益生元，已被证明能通过增加双歧杆菌数量减轻肝病患者症状。其他益生元包括菊粉型果聚糖可以根据聚合程度不同分化为长链和短链，如低聚果糖、果糖-低聚糖。在一些动物NAFLD实验模型中，低聚果糖和果糖-低聚糖被证明能减轻肝脏脂肪变性发展[36]。潜在作用机制包括减少脂肪酸重新合成、通过调节肠道多肽（GLP-1和PYY）减轻体重、减少炎症和促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）、改善血糖调节、调节肠道菌群和改变挥发性有机物[37]。近期Daubioul et al人通过使7名NASH患者服用低聚果糖8周发现其体内肝脏酶和胰岛素血症水平均降低，此结果能较好说明益生元的作用[38]。然而关于益生菌在NAFLD中作用的人体实验还缺乏。

4 结语

肠道细菌种类和数量的变化及代谢性或营养性等危险因素可导致肠粘膜通透性增高和肠道菌群移位，并且可以转录激活肝脏各种各样的促炎基因和细胞因子；LPS暴露于肝脏相当于肝毒素，诱导早期多形核细胞的聚集和急性炎症反应；肠道菌群产生乙醇、氨和乙醛在肝脏代谢并且控制Kupffer细胞的活性和细胞因子的产生；通过NF-kB中介机制，Kupffer细胞启动释放细胞因子比如TNF-α，激活特殊的细胞内途径，通过蛋白酶级联反应激活凋亡信号。所以，肠道菌群可通过多种途径影响NAFLD的发生和发展，益生菌、益生元可通过多种机制延缓NAFLD的进程，使用影像学和组织学评价疗效的大规模随机临床实验仍需验证。

[1]Ley RE，Turnbaugh PJ，Klein S.Gordon microbial ecology:human gut microbes associated with obesity.Nature，2006，444（7122）:1022-1023.

[2]Tilg H，Moschen AR.Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease:the multiple parallel hits hypothesis.Hepatology，2010，52（5）:1836-1846.

[3]Bhatia LS，Curzen NP，Calder PC et al.Non-alcoholic fatty liver disease:a new and important cardiovascular risk factor Eur Heart J，2012，33:1190-1200.

[4]Soderberg C，Stal P，Askling J et al.Decreased survival of subjects with elevated liver function tests during a 28-year followup.Hepatology，2010，51:595-602.

[5]Backhed F，Ding H，Wang T et al.The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:15718-15723.

[6]Drenick EJ，Fisler J，Johnson D.Hepatic steatosis after intestinal bypass-prevention and reversal by metronidazole，irrespective of protein-calorie malnutrition.Gastroenterology，1982，82: 535-548.

[7]Cani PD，Amar J，Iglesias MA et al.Metabolic endotoxemia initi atesobesity and insulin resistance.Diabetes，2007，56:1761-1772.

[8]Saberi M，Woods NB，de Luca Cet al.Hematopoietic cellspecific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.Cell Metab，2009，10:419-429.

[9]Backhed F，Ding H，Wang T et al.The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:15718–15723

[10]Alisi A，Ceccarelli S，Panera N et al.Causative role of gut microbiota in non-alcoholic fatty liver disease pathogenesis.Front Cell Infect Microbiol，2012，2:132.

[11]Machado MV，Cortez-Pinto H.Gut microbiota and nonalcoholic fatty liver disease.Ann Hepatol，2012，11:440-449.

[12]Harte AL，da Silva NF，Creely SJ et al.Elevated endotoxin levels in non-alcoholic fatty liver disease.J Inflamm（Lond），2010，7:15.

[13]Fujimoto Y，Fukase K.Structures，synthesis，and human Nod1 stimulation of immunostimulatory bacterial peptidoglycan fragments in the environment.J Nat Prod，2011，74:518-525.

[14]Verdam FJ，Rensen SS，Driessen A et al.Novel evidence for chronic exposure to endotoxin in human nonalcoholic steatohepatitis.J Clin Gastroenterol，2011，45:149-152.

[15]Miele L，Valenza V，La Torre G et al.Increased intestinal permeability and tight junction alterations in nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology，2009，49:1877-1887.

[16]Wigg AJ，Roberts-Thomson IC，Dymock RB et al.The role of small intestinal bacterial overgrowth，intestinal permeability，endotoxaemia，and tumour necrosis factor α in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis.Gut，2001，48:206-211.

[17]Gabele E，Dostert K，Hofmann C et al.DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH.J Hepatol，2011，55: 1391-1399.

[18]De Gottardi A，McCoy KD.Evaluation of the gut barrier to intestinal bacteria in non-alcoholic fatty liver disease.J Hepatol，2011，55:1181-1183.

[19]Wang Z，Klipfell E，Bennett BJ et al.Gut flora metabolism of phosphatidylcholinepromotescardiovasculardisease.Nature，2011，472:57-63.

[20]Spencer MD，Hamp TJ，Reid RW，et al.Association between composition of the human gastrointestinal microbiome and development of fatty liver with choline deficiency.Gastroenterology，2011，140:976-986.

[21]Corbin KD，Zeisel SH.Choline metabolism provides novel insights into nonalcoholic fatty liver disease and its progression. Curr Opin Gastroenterol，2012，28:159-165.

[22]Yokota A，Fukiya S，Islam KB et al.Is bile acid a determinant of the gut microbiota on a high-fat diet Gut Microbes，2012，3: 455-459.

[23]Turnbaugh PJ.Microbiology:fat，bile and gut microbes.Nature，2012，487:47-48.

[24]Dekaney CM，von Allmen DC，Garrison AP，et al.Bacterial-dependent up-regulation of intestinal bile acid binding protein and transport is FXR mediated following ileo-cecal resection. Surgery，2008，144:174-181.

[25]Trauner M，Claudel T，Fickert P et al.Bile acids as regulators of hepatic lipid and glucose metabolism.Dig Dis，2010，28: 220-224.

[26]Thomas C，Gioiello A，Noriega L，et al.TGR5-mediated bile acid sensing controls glucose homeostasis.Cell Metab，2009，10: 167-177.

[27]Keitel V，Haussinger D.Perspective:TGR5（Gpbar-1）in liver physiology and disease.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2012，36:412-419.

[28]Tremaroli V，Backhed F.Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism.Nature，2012，489:242-249.

[29]Zhu L，Baker SS，Gill C，et al.Characterization of the gut microbiome in non-alcoholic steatohepatitis（NASH）patients:a connection between endogenous alcohol and NASH.Hepatology，2012，doi:10.1002/hep.26093[Epub ahead of print].

[30]Volynets V，Kuper MA，Strahl S et al.Nutrition，intestinal permeability，and blood ethanol levels are altered in patients with nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）.Dig Dis Sci，2012，57:1932-1941.

[31]Li Z，Yang S，Lin H et al.Probiotics and antibodies to TNF inhibitinflammatoryactivityandimprovenonalcoholicfatty liver disease.Hepatology，2003，37:343-350.

[32]Ma X，Hua J，Li Z.Probiotics improve high fat diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance by increasing hepatic NKT cells.J Hepatol，2008，49:821-830.

[33]Loguercio C，Federico A，Tuccillo C et al.Beneficial effects of a probiotic VSL#3 on parameters of liver dysfunction in chronic liver diseases.J Clin Gastroenterol，2005，39:540-543.

[34]Million M，Angelakis E，Paul M et al.Comparative meta-analysis of the effect of Lactobacillus species on weight gain in humans and animals.Microb Pathog，2012，53:100-108.

[35]Aller R，De Luis DA，Izaola O，et al.Effect of a probiotic on liver aminotransferases in nonalcoholic fatty liver diseasepatients:a double blind randomized clinical trial.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15:1090-1095.

[36]Delzenne NM，Cani PD，Neyrinck AM.Modulation of glucagonlike peptide 1 and energy metabolism by inulin and oligofructose:experimental data.J Nutr，2007，137（Suppl 11）:2547S-2551S.

[37]Compare D，Coccoli P，Rocco A，et al.Gut–liver axis:the impact of gut microbiota on non-alcoholic fatty liver disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis，2012，22:471-476.

[38]DaubioulCA，HorsmansY，LambertP，etal.Effectsof oligofructose on glucose and lipid metabolism in patients with nonalcoholic steatohepatitis:results of a pilot study.Eur J Clin Nutr，2005，59:723-726.

（收稿：2013-10-20）（校对：张骏飞）

Perspectives in gut microbiota in non-alcoholic fatty liver diseases

Sun Lu，Lu Xiaolan.Department of Gastroenterology，Second Affiliated Hospital，Jiaotong University School of Medicine，Xi’an 710004，Shaanxi Province，China

Non-alcoholic fatty liver diseases（NAFLD）has an increasing worldwide prevalence.A‘two-hit’mechanism has been accepted，however，its pathogenesis remains to be clarified.Recently，some new findings about gut microbiota in NAFLD have emerged.It might be involved in gut permeability，low-grade inflammation and immune inbalance，and it is believed that it modulates dietary choline metabolism，regulates bile acid metabolism and produces endogenous ethanol.All of these factors are molecular mechanisms by which the microbiota can induce NAFLD or has some roles in the process from NAFLD to overt nonalcoholic steatohepatitis.This review summarizes the main literature findings about the relationships between gut microbiota and NAFLD.

Non-alcoholic fatty liver diseases；Gut microbiota；Lipopolysaccharide

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.035

710004西安市西安交通大学医学院第二附属医院消化内科

孙露，女，24岁，硕士研究生。E-mail：sunlu19890717@163.com

鲁晓岚，E-mail：xiaolan_lu@163.com