5-氨基酮戊酸光动力学疗法在体外对红色毛癣菌的抑制作用研究

梁 义，卢丽明，陈 勇，尹 琦

（柳州市柳铁中心医院皮肤科，广西 柳州 545007）

5-氨基酮戊酸光动力学疗法在体外对红色毛癣菌的抑制作用研究

梁 义，卢丽明，陈 勇，尹 琦

（柳州市柳铁中心医院皮肤科，广西 柳州 545007）

目的评估以5-氨基酮戊酸为光敏剂的光动力疗法在体外对红色毛癣菌的抑制作用。方法以96孔细胞培养板为实验载体，加入红色毛癣菌悬液，分为治疗组和4个对照组，其中治疗组同时给予氦氖激光照射、加入5-氨基酮戊酸、共同避光孵育12 h等三个条件；而4个对照组均不红色毛癣菌同时具备治疗组所获得的三个条件。然后按照设定的实验条件进行5-氨基酮戊酸光动力学治疗，并用噻唑蓝法检测红色毛癣菌的存活率。结果5-氨基酮戊酸的浓度介于0.05%～2.5%之间时，治疗组红色毛癣菌的存活率依次递减，对应的存活率之间进行两两比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，存活率对5-氨基酮戊酸的浓度呈剂量依赖关系。而当5-氨基酮戊酸浓度介于2.5%～10%时，治疗组红色毛癣菌的存活率差异无统计学意义(P＞0.05)，当5-氨基酮戊酸的浓度介于0.05%～10%之间时，对照组中红色毛癣菌的存活率未受影响，四组的红色毛癣菌的存活率变化无明显差异(P＞0.05)。结论在特定浓度下，5-氨基酮戊酸光动力学疗法对红色毛癣菌有明显的抑制作用。

5-氨基酮戊酸；光动力疗法；红色毛癣菌；抑制

我国南方地区温暖潮湿，特别适合各类致病性真菌的生长，因此皮肤真菌感染成为该地区最为常见的皮肤感染之一。皮肤真菌感染如果未得到彻底治疗，在特殊人群中(老年人和免疫力低下者)易发展为系统性真菌感染，带来更严重的危害[1]。现有治疗皮肤真菌感染的方法为口服或外用抗真菌药物，但均对肝肾有一定的毒副作用，因此皮肤科领域急需一种简单易行，毒副作用更少的新疗法。以5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acdi，5-ALA)为光敏剂的光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是近年兴起的一种新型治疗方法，已被大量用于治疗皮肤的各种良恶性肿瘤，如鳞状细胞癌、光化性角化病和基底细胞癌，以及病毒疣等，同时5-ALA-PDT已被证实能够杀灭真菌和细菌[2-4]。在各类致病性真菌之中，红色毛癣菌是最重要和常见的病原菌之一。本实验将评估ALA-PDT在体外抑制或杀灭红色毛癣菌的效果，为下一步将5-ALA-PDT用于治疗由红色毛癣菌感染所致的皮肤真菌感染提供实验室依据，现将研究结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂 红色毛癣菌标准菌株由柳州市柳铁中心医院检验科真菌室提供；5-氨基酮戊酸盐酸盐(ALA)由上海复旦张江生物医药股份有限公司提供。临用前以二甲基亚砜(DMSO)配制成20%的ALA溶液备用。噻唑蓝(MTT)、PBS缓冲液、RPMI1640液体培养基、沙堡氏培养基由Gibico公司提供。

1.2 主要仪器 HJZ-3型氦氖激光治疗机，波长为632.8 nm，输出功率为37 mW，由成都国雄光电技术有限公司提供。

1.3 方法 参照梁义等[5]的方法进行。

1.3.1 红色毛癣菌悬液的制备 将红色毛癣菌在新鲜配制的沙堡氏培养基上连续转种两次，30℃培养，24 h后，取生长良好的菌落5个，用灭菌生理盐水制成悬液。通过血细胞计数板调整含菌量，使菌悬液含菌量为1×106CFU/ml(集落形成单位，Colony forming units)。需进行MTT检测时将菌悬液接种入96孔细胞培养板，每孔100 μl。

1.3.2 红色毛癣菌的分组 将红色毛癣菌分成：(1)治疗组：往96孔细胞培养板中加入不同量的ALA溶液，使每孔的ALA的终末浓度分别为10%、5%、2.5%、1.25%、1.0%、0.5%、0.25%、0.125%、0.05%。每个浓度的ALA分别加入12个培养孔，并于35℃避光孵育12 h。(2)4个对照组：a：单纯的红色毛癣菌悬浮液，无ALA-PDT处理；b：红色毛癣菌悬浮液加入不同浓度的ALA共同孵育，无激光照射；c：红色毛癣菌悬浮液未加入ALA，只予激光照射；d：红色毛癣菌悬浮液加入不同浓度的ALA后立即予激光照射。每组12孔细胞，除d组外均于35℃避光孵育12 h。

1.3.3 氦氖激光照射 用光导纤维把激光引到培养孔上方，激光头与培养板的垂直距离为0.5 cm，使光斑直径为0.32 cm，刚好能覆盖培养孔上口，照射的能量密度为55 J/cm2。按此方法对治疗组和对照组中的c组、d组进行照射。

1.3.4 MTT法检测红色毛癣菌的存活率 将上述经过处理的治疗组和4个对照组的红色毛癣菌放入湿盒内，35℃避光孵育后进行MTT检测，具体操作按照说明书进行。为确保研究结果的准确性，以上研究步骤重复三次。所得数据均以均数±标准差()表示。

1.4 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件，多组间多样本均数比较行方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组a存活率为(96.1±2.4)%，对照组b存活率为(92.1±3.3)%，对照组c存活率为(97.1±1.2)%，对照组d存活率为(93.1±6.1)%，四者比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明对照组中红色毛癣菌的活性未受到明显抑制。治疗组中，当ALA浓度分别为0.05%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、1.25%、2.5%、5%和10%时，经过PDT处理后，用MTT法检测红色毛癣菌的存活率分别为(86.1±3.3)%、(78.3±2.5)%、(69.7±1.7)%、(61.7±4.3)%、(48.9±5.1)%、(36.5±4.6)%、32.4±6.2)%、(30.6±3.2)%和(28.9±5.4)%。对以上存活率进行统计分析发现，当ALA浓度分别为0.05%、0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、1.25%、2.5%时，对应的存活率之间进行两两比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。而当ALA浓度分别为2.5%、5%、10%时，其对应的存活率之间进行两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。表明当ALA浓度从0.05%递增至2.5%时，红色毛癣菌的存活率依次递减，存活率对ALA的浓度呈剂量依赖关系，而当ALA浓度位于2.5%～10%时，红色毛癣菌的存活率无明显差异。

3 讨论

红色毛癣菌是导致皮肤真菌病的主要病原菌之一，在地域上多发生于湿热的南方地区；好发人群为老年人或伴有糖尿病、肾病、恶性肿瘤等内科疾病者。目前治疗皮肤真菌病主要采用局部外用或系统使用抗真菌药物的方法，但均难以防止复发。系统使用抗真菌药物治疗皮肤真菌病周期长，费用高，对肝肾有一定的毒副作用，更易导致真菌产生耐药性；这些局限性制约了该方法在上述好发人群中的应用。ALA-PDT已被广泛用于临床治疗皮肤肿瘤，疗效肯定，副作用少。本实验旨在评估ALA-PDT在体外对红色毛癣菌活性的抑制效应，为将来使用ALA-PDT疗法在临床上治疗皮肤真菌病提供实验依据。

光敏剂、激发光是ALA-PDT的基本要素，ALA是目前应用最为广泛的、可以局部外用的光敏剂。国内外在体外进行ALA-PDT抑制红色毛癣菌活性的研究中，所获得的研究结果差异很大，但普遍认为ALA-PDT能不同程度杀灭或抑制红色毛癣菌。但对ALA的浓度、使用何种化学试剂作为ALA的穿透促进剂、ALA与红色毛癣菌共同孵育的时间均有不同看法；通过多次预实验和摸索，本实验的治疗组采用ALA的浓度介于0.05%～10%之间，采用DMSO作为ALA的穿透促进剂[6-7]，ALA与红色毛癣菌共同孵育的时间为12 h。结果表明，ALA的浓度介于0.05%～2.5%之间时，经过与ALA共同孵育12 h后再进行PDT，红色毛癣菌的存活率依次递减，存活率对ALA的浓度呈剂量依赖关系。而当ALA浓度介于2.5%～10%时，红色毛癣菌的存活率无明显差异。本实验的对照组中红色毛癣菌的存活率未受到影响，说明单纯激光和只加ALA无激光光照，或红色毛癣菌悬浮液加入ALA后，孵育时间不足，均对红色毛癣菌的存活率无明显的影响。因为对照组不能同时具备光敏剂、激发光基本要素，因此不能引发ALA-PDT的治疗作用，其充分说明本实验采用的方案是合理、有效的。

本实验发现ALA必须与红色毛癣菌共同孵育一定时间后才能产生足够的PpIX。国外研究认为不同种类的真菌，孵育的时间也不同；ALA的浓度达到一定值后，再增高ALA的浓度，PDT并不能提高对真菌的存活率的影响。究其原因，可能与红色毛癣菌把ALA转化为PpIX的能力以及孵育过程中pH的变化有关[8-9]。国外研究结果能够部分解释了本实验所获得的成果，但本实验的例数、规模、各种观察指标和验证手段仍有待进一步的深入研究，才能得出更精确的结论。

本实验证实，ALA-PDT在体外能有效地抑制红色毛癣菌，ALA浓度为2.5%时抑制效果最好，可以作为ALA-PDT治疗红色毛癣菌引起的皮肤真菌感染的实验依据。但该疗法应用于人体的情况如何，仍需做更深入研究，有望成为治疗皮肤真菌感染的新方法。

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Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Trichophyton rubrum in vitro.

LIANG Yi,LU Li-Ming, CHEN Yong,YIN Qi.Liuzhou Railway Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Trichophyton rubrum in vitro.Methods96-well cell culture plates were used as experimental carriers for adding Trichophyton rubrum suspension,which were divided into experimental group and four control groups.He-Ne laser irradiation, 5-aminolevulinic acid and avoiding light incubation for 12 hours were given in the experimental group at the same time.But four control groups did not received three conditions at the same time.Then ALA-PDT was done under experimental conditions.The survival rate of Trichophyton rubrum was detected by MTT.ResultsWhen the concentration of ALA ranged from 0.05%to 2.5%,the survival rate of Trichophyton rubrum decreased in experimental group(P＜0.05).The survival rate and the concentration of ALA were in a dose-dependent manner.When the concentration of ALA ranged from 2.5%to 10%,there was no significant difference in the survival rate of Trichophyton rubrum(P＞0.05).The survival rate of Trichophyton rubrum in four control groups were not affected,and there was no significant difference(P＞0.05).ConclusionALA-PDT could effectively inhibit the growth of Trichophyton rubrum when ALA is within specific concentration range.

5-aminolevulinic acdi;Photodynamic therapy;Trichophyton rubrum;Inhibition

R379.2+2

A

1003—6350（2014）23—3436—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1346

2014-06-27)

广西卫生厅课题（编号：Z2012552）

梁 义。E-mail：liangyi007030@sina.com