热休克蛋白90与不良妊娠结局的相关性研究

于湄 张雪玲 孟艳岑 范玉香

近年来，不良妊娠的发生率越来越高，对于不良妊娠的影响因素众说纷纭，包括妊娠期高血压、肥胖、过度紧张、年龄较高等，而对于其发生机制尚无定论。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是所有生物细胞在应激原刺激后，发生热休克反应时产生的一类细胞伴侣蛋白的总称。研究证实，HSP对于肿瘤细胞的分化及凋亡的调控有重要作用。本课题以不良妊娠患者为研究对象，观察比较正常妊娠组及不良妊娠组孕妇外周血及胎盘组织中HSP90的表达情况，为探讨热休克蛋白90与不良妊娠发生的关系，试图探索不良妊娠期发病机制，以便为更好的防治本病，降低不良妊娠奠定理论基础

1 资料与方法

1.1 一般资料2009年10月至2010年10月在我院住院分娩的孕妇共170例，年龄22～34岁，平均年龄28.85岁，所有病例均为单胎初次分娩，无基础疾病:(1)正常妊娠组:共70例，体重60～90 kg，平均73 kg，足月顺产，未出现不良母婴并发症;(2)不良妊娠组:共100例，体重62～89 kg，平均73 kg，出现妊娠期高血压疾病、甲功异常、早产、胎膜早破、胎儿生长受限等母婴不良妊娠结局。2组一般资料有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 外周血及胎盘组织标本采集:所有研究对象晨起空腹采肘静脉血2 ml。将采集到的血液标本置入不含抗凝剂的试管中，混匀，待血液完全凝集后4℃条件下3 000 r/min离心10 min，取上清液置于另一个无菌不含抗凝剂的试管中，-80℃保存待测。在胎盘娩出后，立即切取指腹大小的胎盘组织，包于无菌锡箔纸中，-80℃保存待测。

1.2.2 ELISA检测外周血血清中HSP90的含量:在酶标检测仪上，以空白对照孔调零后，在450 nm处分别读出各孔的OD值，经酶标仪内置分析软件，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，自动绘制标准品曲线。根据各孔待检测样品(血清)的OD值可在标准曲线上查出其相应的浓度。

1.2.3 Real-time PCR检测胎盘组织中HSP90 mRNA的含量:Real-time PCR试剂购自大连TAKARA生物科技有限公司，严格按照试剂说明书进行实验操作。根据Primer5.0软件设计引物序列。HSP90引物序列为:上游引物(5’-3’):GATAAGGCAGTTAAGGACC，下游引物(5’-3’):ATAGATGCGGTTGGAGTG;以 βactin作为内参，上游引物(5’-3’):GAGACCTTCAACACCCCAG，下 游 引 物(5’-3’):GCCATCTCTTGCTCGAAGTC;引物交由大连TAKARA生物科技有限公司合成。采用二步法进行荧光定量PCR，先进行95℃，30 s的热启动，再进行95℃，5 s的预变性，然后进行60℃，20 s 40个循环PCR反应，每个循环结束收集荧光，根据荧光强度绘制扩增曲线。95℃30 s，55℃30℃，95℃30 s，5～95℃每隔0.3度收集荧光，根据荧光强度经换算生成熔解曲线，进行质量控制。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05认为有统计学差异。

2 结果

2.1 外周血血清中HSP90的含量 正常妊娠组与不良妊娠组外周血中HSP90水平分别为(0.6±0.4)ng/ml，(1.6±0.4)ng/ml。2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 胎盘组织中HSP90mRNA的含量 正常妊娠组与不良妊娠组胎盘组织中HSP90含量分别为(1.15±0.03)，(3.89±0.78)。与正常妊娠组相比，不良妊娠组胎盘组织中HSP90水平明显高于正常妊娠组(P＜0.05)。

3 讨论

HSP是所有生物细胞在应激原刺激后，发生热休克反应时产生的一类细胞伴侣蛋白的总称。HSP90是热休克蛋白家族中的重要成员之一，是存在于真核生物和细菌中的一种基本的重要分子伴侣，是细胞内最活跃的分子伴侣蛋白之一，作为特异分子伴侣的HSP90参与多种信号途径中的激酶和核受体家族、P53等转录因子活性的调节，在细胞生长发育、分化、蛋白质合成、折叠运输和分解、细胞骨架的功能、膜功能以及应激条件下对细胞的保护等生理代谢中起着重要的生物学作用。HSP90通过与100多种底物蛋白质相互作用，参与调控和维持多种蛋白的构象和作用，对细胞内许多生物过程如细胞生长、分化和凋亡都有重要作用［1］。机体遭受组织损伤、病原微生物感染、炎性细胞因子等均可引起HSP的过量表达，以维持细胞的正常功能。

有研究提示，HSP90在妊娠期高血压组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组胎盘中的蛋白和基因表达明显强于正常组，且呈逐渐加强的趋势［2］。不良妊娠的发生是多种因素作用，其具体机制尚不明确。HSP90参与细胞周期的调控，通过肿瘤研究发现HSP90活性被抑制后可以使乳腺癌细胞株停滞在G1期，而且这种阻滞的发生依赖于细胞内Rb的表达，并最终会导致细胞分化或凋亡［2，3］，因此，HSP90对细胞周期的调控具有重要作用。本研究中，不良妊娠组胎盘组织及外周血中HSP90的表达明显高于正常妊娠组，提示HSP90可能参与了不良妊娠的发生过程，具体机制尚待进一步的研究。

近年来研究发现，HSP90高表达与恶性肿瘤的发生有关，它能与细胞内的一些辅分子伴侣结合成不同的多蛋白复合体，并通过维持期“受体蛋白”，如Akt、Raf-1、HER-2/nen等的稳定和活性间接地调控细胞内多条与细胞增殖、分化、存活以及凋亡有关的信号传导通路，其独特的性质使其成为抗肿瘤治疗的良好靶点，认为其抑制剂为有希望的抗癌治疗药物［2-4］。HSP90能与活化蛋白激酶C受体竞争性结合HIF-1α，从而使其免于非氧依赖方式的降解以维持其稳定，并影响低氧时低氧诱导因子的核转位、与HIF-1β的异二聚化及转录活性等，进而抑制其细胞凋亡。HSP是一种应激蛋白，广泛存在于人、动物、微生物内。有研究表明，通过检测血清中HSP70，可间接反映疾病与热休克蛋白之间相互作用的关系［4］。妊娠期高血压疾病时升高的血清HSP70不仅仅来源于胎盘组织的释放，亦来自疾病严重时累及其他脏器时机体的应激反应［4］。随HELLP程度加重，血清HSP70含量越高，因此血清HSP70含量在HELLP诊断、疗效观察及衡量疾病严重程度方面具有重要的临床价值［5］。

刘彦霞等［6］研究发现，与正常者相比，在胎盘血管病患者中HSP70表达明显增高，提示HSPs高表达引起了内在免疫应答及炎性反应，参与胎盘血管病的发生机制。另外，HSP90伴侣分子的干扰可引起Pnck诱导的EGFR降解，从而干扰新生血管的形成［7］。Rangaraju等［8］研究发现，HSPs在神经病学模型中可以诱导髓鞘的发生，说明HSPs可以参与神经系统的发育;Luo等［9］通过实验也发现，HSP90β同样参与了乙酰胆碱受体的构建及稳定。本研究发现，不良妊娠结局如妊娠期高血压疾病、胎儿生长受限患者其血清及胎盘组织中HSP90的含量明显高于正常妊娠，且与疾病的严重程度呈正相关，说明其在不良妊娠的发生、发展过程中有一定作用。研究表明，妊娠期高血压疾病的发病机制是由于滋养细胞浸润不足减少子宫胎盘灌注，导致胎盘缺血缺氧，诱发生物活性因子的释放，导致血管效应而产生血压升高［9］。在胎儿生长受限时，子宫螺旋动脉壁出现大量泡沫细胞，即急性粥样硬化现象，因而导致子宫胎盘血流量降低，导致低氧状况，出现胎盘功能不良，从而影响胎儿的生长及发育。机体细胞受到各种应激刺激如缺氧、缺血，感染等刺激的情况下会释放多肽，同时携带具有免疫原性的多肽，产生免疫反应，这些因素有可能增加HSP90的表达，进而致使循环中HSP90水平增高。HSP90参与了胎儿的生长发育的某些重要过程，其与不良妊娠结局的发生关有一定关系，其具体机制尚需进一步研究。

1 Zhao R，Houry WA.Molecular interaction network of the Hsp90 chaperone system.Adv Exp Med Biol，2007，594:27-36.

2 Strethapakdi M，Liu F，Tavorath R，et al.Inhibition of Hsp90 function by ansamycins causes retinoblastoma gene product-dependent G1 arrest.Cancer Res，2000，60:3940-3946.

3 Munster PN，Srethapakdi M，Moasser MM，et al.Inhibition of heat shock protein 90 function ansamycins causes the morphological and functional differentiation of breast cancer cells.Cancer Res，2001，61:2945-2952.

4 赵勇，耿素敏，张瑞清，等.妊高症患者血清热休克蛋白70水平的表达及意义.中国卫生检验杂志，2009，19:135-136.

5 耿素敏，赵勇，严真真.血清热休克蛋白70在重度子痫前期合并HELLP综合征中的价值探讨.中国医药导刊，2009，11:2100-2101.

6 刘彦霞，徐健，王欣.热休克蛋白70与胎盘血管病中内皮激活的相关研究.实用妇产科杂志，2010，26:222-226.

7 Deb TB，Zuo AH，Wang Y，et al.Pnck induces ligand-independent EGFR degradation by probable perturbation of the Hsp90 chaperone complex.Am J Physiol Cell Physiol，2011，300:C1139-1154.

8 Rangaraju S，Madorsky I，Pileggi JG，et al.Pharmacological induction of the heat shock response improves myelination in a neuropathic model.Neurobiol Dis，2008，32:105-115.

9 Luo S，Zhang B，Dong XP，et al.HSP90 beta regulates rapsyn turnover and subsequent AChR cluster formation and maintenance.Neuron，2008，60:97-110.