肾移植排斥反应的生物学标志物

吴奥综述，杨顺良审校

（南京军区福州总医院泌尿外科，福建 福州 350000）

肾移植排斥反应的生物学标志物

吴奥综述，杨顺良审校

（南京军区福州总医院泌尿外科，福建 福州 350000）

尿毒症是各种肾病终末期的转归，肾移植术是目前治疗尿毒症的最佳方案，但由于不同个体免疫组织相容性复合物不同，往往在移植术后发生各种类型的排斥反应，严重影响移植肾的功能和受者的生活质量，所以临床需要一种高特异性、高敏感性的生物学标志物早期预示排斥反应发生的高危性，从而让临床医生能够更改治疗方案，避免移植物的损害。近些年，越来越多的关于这类生物学标志物的研究已经开展。

肾移植；排斥反应；生物学标志物

同种异体肾移植已成为终末期肾病患者最佳的治疗方案[1]，随着配型及外科技术的不断进步，以及新的免疫抑制剂的应用，肾移植受者术后急性排斥反应(Acute rejection，AR)的发生率明显下降[2]，但移植术后急慢性排斥反应仍然严重威胁着受者移植器官的远期存活，所以及时准确地发现排斥反应的发生变得尤为重要。病理检查是明确诊断排斥反应的金标准[3]，但有创的诊断方法可能产生诸多并发症，如出血、感染等。而且在移植肾穿刺活检诊断急性排斥反应同时，排斥反映造成的移植物损伤已经形成[4]。这几年相关研究人员致力于寻找一种生物学标志物(Biomarker)能准确反映受者的免疫状态或者移植物的生存状态，建立可靠的免疫监测方法，指导临床及时更改免疫抑制剂的使用方案，以免产生感染、肿瘤或者排斥反应等免疫抑制剂过量或者不足的并发症，还能够为临床移植免疫耐受的诱导提供必要条件。近5年重点研究的生物学标志物有以下4种，现对每一种标志物做一概述。

1 可溶性CD30(Soluble CD30，sCD30)

CD30分子是肿瘤坏死因子/神经生长因子受体(TNF/NGNR)超家族的一员，其属于一种糖蛋白，表达于具有分泌Th2类细胞因子功能的T细胞表面。当CD30+T细胞激活时，其胞外CD30能被蛋白酶切断水解，生成可溶性的CD30(sCD30)分子。Th1型细胞因子能够促进移植物抗原特异性的细胞毒性T细胞活化、增殖和分化，诱发迟发型变态反应，从而启动或加速移植物排斥反应；Th2细胞可抑制Th1细胞分化及其细胞因子表达，调控移植排斥反应，促进免疫耐受。CD30表达在分泌Th2类细胞因子的T细胞表面，CD30与Th2相关性提示CD30可能作为Th2细胞激活的标志物，从而可能作为移植排斥反应的监测指标。

正常人血清中也能检测到低水平的sCD30表达，但终末期肾病患者体内能检测到高水平的sCD30分子。目前临床上采用检测群体反应性抗体(Panel reactive antibodies，PRA)的方法初步评估受者的免疫状态，PRA是被临床已经证实且广泛应用的一类标志物，对终末期肾病患者来说，群体反应是预估肾移植后免疫危险的一个重要指标。根据群体反应型抗体是否超过50%划分免疫应答水平，群体反应性抗体＞50%预示其发生早期排斥反应的危险性大，移植肾存活率可能会明显降低。苗书斋等[5]研究发现，群体反应性抗体阴性患者若检测出sCD30阳性，发生急性排斥反应的概率显著升高(21%vs 5%，P=0.019)，两者同时阳性的患者急性排斥反应发生的概率明显高于两者同时阴性患者(42%vs 7%，P=0.001)，说明sCD30的阳性表达与肾移植后急性排斥反应发生有关。王栋等[6]利用ELISA方法分别在术前、术后5 d、10 d检测231例肾移植受者的血清sCD30水平，根据肾移植受者术后1个月内临床表现将他们分为三组，分别为急性排斥反应组(AR)、肾功能延迟恢复组(DGF)和正常组(UC)，发现AR组术后5 d血清sCD30水平为(92±27)U/ml，明显高于UC组的(41±20)U/ml和DGF组的(48±18)U/ml，差异分别有统计学意义，但三组之间两两比较差异无统计学意义。并认为肾移植术后5 d sCD30水平可以预测近期内即将出现急性排斥反应，并提出将65 U/ml作为临界点可以较好地预测急性排斥反应(特异性91.8%，敏感性87.1%)。李川江等[7]采用ELISA法对20例肾移植术后发生急性排斥反应者和22例肾移植术后顺利恢复者的外周血sCD30水平进行动态监测，发现排斥组具有较高的sCD30水平，与无排斥反应组比较，术后5 d、7 d差异有统计学意义(P＜0.05)，且排斥组在甲强龙冲击后sCD30水平明显下降；但糖皮质激素耐受者sCD30水平下降的慢，提示sCD30水平动态变化可作为肾移植急性排斥反应的诊断指标，以及判断排斥反应对糖皮质激素冲击治疗是否敏感的指标。

但是，最近发现sCD30水平预测肾移植术后急性排斥反应的特异性及相关性尚存在不足。Hatim等[8]随机从50例肾移植受者中选取一部分患者检测移植术后第0、3、5、6、14、21天及第1、3、6、12个月血清sCD30，根据随访以及病理检查情况将患者分为四个组，分别为无并发症组(1组，56%)、急性排斥反应发作组(2组，18%)、ATN(肾小管坏死)组(3组，16%)、其他诊断组(4组，10%)。对相关数据整理分析发现1、2、3组所有患者血清sCD30水平在移植术后急剧下降，第4组下降幅度差异无统计学意义。1个月以后发生急性排斥反应的患者移植前sCD30水平明显高于1个月之内发生排斥反应患者的sCD30水平，最终1年连续检测的sCD30水平在四组之间差异无统计学意义。Chen等[9]对移植前血清游离CD30作为肾移植术后急性排斥反应的一个预测指标的相关研究进行了Meta分析，12项研究募集了2 507例患者参加，发现移植前sCD30水平预测肾移植AR的风险较大，灵敏度为0.70，特异性为0.48，阳性率拟然比为1.35，阴性拟然比为0.68，从而认为采用移植前sCD30水平预测肾移植术后AR的准确性较差。

移植前血清sCD30水平与肾移植术后急性排斥反应的相关性尚不确定，有文献报道了血清sCD30水平可能可以用来预测肾移植术后急性排斥反应的发生[5-7]，同时也有文献报道术前血清sCD30水平作为预测肾移植术后急性排斥反应的特异性和灵敏性尚存不足[8-9]。移植前血清sCD30水平与肾移植术后急性排斥反应相关性如何，能否预设出一定的血清sCD30水平参考值用来在术前术后不同的时间点作为对照，及时了解受者的免疫状态等，都有待于更大样本量更有说服力的研究证明。

2 信使RNA(mRNA)

mRNA是携带遗传信息的、能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸，存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器中，是DNA转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸(RNA)。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链和氨基酸的排列顺序。排斥反应过程中肾小管和毛细血管周围伴随着炎性细胞的入侵，mRNA可能通过基因的表达参与排斥反应的过程。谭湘芳等[10]研究发现外周血淋巴细胞(PBL)穿孔素和颗粒酶B mRNA在急性排斥反应发生前3 d两者表达水平明显上升，在AR后1 d表达水平达到最高峰，然后经MP/OKT3冲击治疗后，PBL穿孔素和颗粒酶B mRNA表达水平逐渐降低至原有基础水平，从而认为PBL穿孔素和颗粒酶B mRNA在AR早期诊断和抗排斥反应疗效评估等方面具有一定的临床价值。Wang等[11]选取19例肾移植术后发生急性排斥反应的患者、20例移植术后发生慢性移植肾功能不全的患者和21例移植术后稳定的患者为研究对象，研究不同组别之间外周血单核细胞表达程序性死亡分子-1(PD-1)mRNA的水平时，发现急性排斥反应组表达PD-1 mRNA的水平高于其他两组，且差异具有统计学意义，提示监测外周血PBL中PD-1可能成为一个新的标志物来预测急性排斥反应的发生。Iwase等[12]采用RT-PCR技术研究272例肾移植术后患者外周血中Foxp3、转化生长因子-β、细胞毒性T淋巴细胞抗原4、CXCR-7、TlR4、颗粒酶B、GATA3等一些在免疫细胞功能中发挥重要的关键因子mRNA表达时，发现Foxp3的信使核糖核酸(mRNA)的水平移植后降低但逐渐恢复，慢性排斥反应受者表达低水平的Foxp3、CXCR-7、颗粒酶B、TlR4和蛋白酶体亚基β10，其中Foxp3是最相关的指标。

总体来说，随着mRNA提取和保存技术的进步，mRNA实验的开展得到进一步保障，mRNA实验可作为一种技术平台应用于移植免疫监测生物学标志物的寻找。已有文献报道了一些和肾移植排斥反应相关的指标[10-12]，但未就具体参与肾移植排斥反应的机制阐明，存在诸多的不确定性，该如何应用于临床更有待于后续研究去完善。

3 微小RNA(microRNA)

miRNAs是长度为19～22个核苷酸的非编码RNA，是sRNA的一种，也被称之为微小RNA、小核RNA、PIWI(P-element induced wimpy testis)或小干扰RNA等，在生理和病理过程中具有重要的调节功能[13]。Pri-miRNA在细胞核内核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。后者具有一个典型的茎-环结构，pre-miRNA在细胞核内生成之后被运输到胞质，而后被另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)中，其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。这些决定miRNAs具有高度保守性和组织特异性。许多研究表明某些特定的miRNA在一些疾病中表现出有特异性(如miR-21和miR-29与心肌纤维化)[14]。近几年蛋白质组学已经被运用于寻找急性移植物排斥反应新的生物标志物中，微阵列分析技术也被用于实体器官移植监测中。Danger等[15]研究肾移植术后抗体介导的慢性排斥反应(Chronic antibody mediated rejection，CAMR)患者外周血单核细胞表达的257种miRNAs时发现miR-142-5p在外周血单核细胞和移植物活检组织中都降低，可能的原因是CAMR患者外周血单核细胞中可能缺乏一种调控miR-142-5p表达的酶或者机制，ROC分析曲线也显示miR-142-5p可能是一种潜在的预测CAMR发生的标记物，并且可以帮助了解慢性排斥反应发生的机制。Sui等[16]以3例被活检证实患有急性排斥反应的受者移植肾组织为研究材料，以3例肾肿瘤切除标本远离肿瘤组织的正常肾脏皮质为对照材料，按照常规miRNA实验方法，先提取组织中总RNA，再提取miRNA，检验RNA纯度和质量之后用miRNA芯片技术筛查两组表达明显差异的miRNA。结果显示在检测到的71种miRNA中，12种miRNA表达下调，8种表达上调，并且用RT-PCR证明结果的准确性，最后证实miRNA可能参与了急性排斥反应的发生，miRNA有助于诊断、治疗、预防急性排斥反应。但是这一观点还需进一步的实验去完善，以证实这些表达差异的miRNA在急性排斥反应中的作用及如何作为一类靶点在治疗方面来引导我们未来去防止或应对急性排斥反应的发生。

移植术后排斥反应是移植术后一种威胁生命的并发症，其通过改变蛋白编码基因的表达而发生，miRNA的主要功能是调控基因的表达。所以，研究miRNA在肾移植排斥反应中的表达差异具有一定意义。目前miRNA的大多研究[16]都是筛查不同样本miRNA的表达差异，更进一步的研究则是在表达差异的miRNA中筛选一种或几种差异明显的miRNA，继续探讨其与排斥反应的相关性，及引起其对应的具体基因是什么，如何参与排斥反应等。采用RNA芯片筛选出与某些疾病或者生理过程相关的高表达或者低表达的miRNA，并以此为靶点研制出一种新型制剂，能够特异性的作用于病变组织或者脏器的特定miRNA抑制或者促进疾病相关过程的发展，那么，移植患者的生存率有望得到进一步提高。

4 抗内皮细胞抗体(AECA)

抗内皮细胞抗体(AECA)是存在于外周血中的一种自身免疫性抗体，其抗原为表达于血管内皮细胞表面或者吸附于其上的一组异质性抗原。AECA广泛出现在诸多免疫相关性疾病的外周血中，如系统性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎、白塞病、系统性硬化(SSc)等[17]。HLA抗体在肾移植中的危害性已经熟知，但非HLA类抗体在肾脏移植中的重要性仍然没有得到解决，Banasik等[18]研究HLA抗体和非HLA抗体在肾移植术后排斥反应的影响时连续检测35例肾移植术后5年肾功能稳定的患者的抗体，抗体包括HLA抗体和非HLA抗体(AECA、AT1R抗体、ETAR抗体)，发现抗体阴性组(n=13)患者的肾功能明显优于抗体阳性组(包括HLA抗体和非HLA抗体，n=22)。活检证实抗体阴性组2例发生急性排斥反应(2/13，15%)，抗体阳性组则为8例患者(8/22，36%)，发现非HLA抗体在肾移植术后急性排斥反应中也起到关键作用。Han等[19]用酶联免疫吸附法(ELISA)回顾性研究392例肾移植患者(PRA阴性)术前血清AECA检测发现，AECA阳性组AR的发生率明显高于阴性组(35.5%vs 22.4%，P=0.023)，且阳性组发生Ⅱ级T细胞介导的排斥反应(TMR)和抗体介导的排斥反应(AMR)的概率明显高于阴性组，从而认为AECA阳性可作为AR的一个独立的危险因素，并且AECA的出现往往预示着较严重的排斥类型。AECA能引起超急性排斥反应，直接导致移植肾功能丢失。Sun等[20]回顾性研究653例尸体肾移植患者发现，47例发生急性血管排斥反应(AVR)的患者中有13例循环血中AECA阳性，另外2例发生超急性排斥反应患者也检测到AECA可疑阳性，以26例AECA阴性的AVR为对照组，相比于ACEA阴性组而言阳性组术后一年的移植肾的生存率明显降低(46.7%vs 80.5%，P=0.038)，说明AECA往往与移植术后急性排斥反应密切相关，预后较差。

一般而言，排斥反应特别是急性体液排斥反应是由人类白细胞抗原(HLA)所介导，而非HLA抗体也能介导急性体液排斥反应的发生。AECA就是一种在移植物排斥反应中起重要作用的非HLA类抗体。相关报道发现AECA阳性的患者更易发生急性排斥反应[18-20]，可以作为一类预后指标。然而，其致病的具体机制不完全清楚，尚需进一步深入研究明确其真正的致病作用。最近，更有报道AECA在肾移植慢性排斥反应中也有一定的作用[21]。

同种异体肾移植是治疗多种原因所致慢性肾功能衰竭的有效方法。由于排斥现象的存在，如何减轻排斥，延长移植肾的生存期一直是人们关注的课题。早期并且及时发现排斥反应的发生能够避免一部分移植肾功能丢失，目前临床诊断排斥反应采用肾穿刺活检，但穿刺活检术有较多的并发症且存在穿刺点的选择问题。近些年相关研究人员一直在寻找一种易获得的能够早期准确提示发生排斥反应高危性的生物学标志物。随着生物学技术的进步和分子生物学技术的发展，肾移植术后排斥反应标志物的研究有了一个发展的平台，蛋白组学、microRNA、mRNA提取和保存技术的应用也为标志物的发现开辟了新途径，sCD30、microRNA、mRNA、AECA等只是一部分已开展研究的指标，其实用性、准确性、特异性有待进一步证明，新的标志物的发现有待于研究人员的不懈努力。

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Biological markers of rejections in renal transplantation.

WU Ao,YANG Shun-liang.Departmeng of Urinary Surgery,Fuzhou Gernal Hospital,Fuzhou 350000,Fujian,CHINA

Uremia is the terminal outcome of all kinds of nephropathy. Renal transplantation is the best solutionin the treatments of uremia. However, due to different individual immune histocompatibility, different types of rejectionmay occur after transplantation which would severely affect the life quality of recipients and the function oftransplant kidney. So, biological markers with high specificity and sensitivity are clinically called to indicate the riskof rejections at early phase. In that case, physicians can change their treatments so as to protect transplants. In recentyears, more and more researches on this field have been carried out.

Renal transplantation;Rejections;Biological markers

R692

A

1003—6350（2014）19—2875—04

2014-03-02)

杨顺良。E-mail：whszyywa@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1131