RAP80在DNA损伤反应中的作用

郝玮玮，宋锐锋，曾引才，徐 峰

(郑州大学第一附属医院消化内科 河南郑州 450052)

DNA在遭受电离辐射、类辐射性药物、化学损伤等刺激后会发生DNA双链断裂(Double-strand break，DSB)，此时 DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)调控激活一系列细胞周期检查点、DNA修复网络并促使凋亡反应发生，以确保精确修复损伤位点，维持基因的完整性。许多研究报道，受体相关蛋白80(receptor-associated protein 80，RAP80)在DNA损伤反应中有着重要作用，可促使一系列修复蛋白定位到正确的DNA损伤位点。现对RAP80在DNA损伤反应中的作用综述如下。

1 RAP80的结构与功能

1.1 RAP80的结构 RAP80定位于人类染色体5q35，基因片段全长超过90 kb，具有15个外显子及14个内含子，编码一个含有719个氨基酸，分子质量为79.6 kDa的蛋白。RAP80一级结构的N末端有两个核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，在 C末端还有第三个NLS，其中N末端第二个NLS对其在细胞核内定位起着关键性的作用。激光共聚焦显微镜也发现 RAP80主要以斑点型分布于细胞核内［1］。RAP80蛋白羧基端包含两个锌指结构，氨基端包含两个泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motifs，UIM)的核内蛋白。在电离辐射族诱导的损伤中，UIM及204-304氨基酸区是RAP80重新定位所必需的［2］。现已在多种蛋白内发现有UIM结构，其在细胞胞吞、泛素化和 DNA复制、转录、修复等方面均有重要作用［3-4］。

1.2 RAP80的功能 2002年，首次克隆分离出RAP80，发现其高表达于睾丸及卵巢，此外在乳腺、心脏等器官也大量表达。酵母双杂交实验证实，RAP80可与类固醇激素核受体超家族成员RTR结合，并调节部分发育相关基因的表达［1］。近期又有研究表明RAP80通过依赖激动剂的方式与雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)作用，并可调节 ERα 的转录活性［5］。此外还发现，RAP80可与泛素相关小修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier，SUMO)结合酶 UBC9结合而被SUMO化，但SUMO化后的RAP80与DDR信号传导的作用尚不知晓［6］。目前关于RAP80的研究主要集中于DNA损伤修复定位。

2 RAP80与DNA损伤修复定位

DSB发生时，为确保基因完整性和细胞定位损伤位点，通过周期停滞修复DNA及细胞凋亡，对DNA损伤产生反应。在DNA受到损伤后，一系列DDR相关的蛋白迅速结合，并聚集在细胞核损伤灶周围，该定位过程涉及多种严格控制的翻译后修饰手段，包括乙酰化、磷酸化、泛素化，SUMOA化等。近来，一种肿瘤抑制基因(也被称为乳腺癌易患基因)BRCA1在DNA损伤修复、维持基因完整性及细胞的正常发育中所起的作用日益受到重视。而在其作用过程中涉及一系列蛋白，包括 CCDC98/Abraxas，RAP80，MDC1，RNF8 和UBC13等，其中RAP80在损伤后的定位过程中起关键作用［7-8］。

以电离辐射导致的损伤灶(ionizing radiation-induced foci，IRIF)为例。DNA损伤后，共济失调—毛细血管扩张突变基因(ataxia-telangiectasia mutated geng，ATM基因)可快速磷酸化组蛋白 H2A亚型H2AX的C末端，此磷酸化H2AX(即γ-H2AX)在DSBs产生后数秒即开始出现，10 min达到高峰。有研究表明，在H2AXC末端磷酸化位点发生突变时，一系列与调节及修复有关的蛋白无法大量正确定位于IRIF［9］。这说明 γ-H2AX在 DDR相关蛋白定位于IRIF起着重要作用。DNA损伤检测点介质1(DNA damage checkpoint 1，MDC1)的 C末端区包含两个BRCA1的 C末端结构区(BRCA1 C-terminal repeat，BRCT)，N末端区包含一个叉状头部区(forkhead-associated，FHA)。通过 BRCT结构域，MDC1可与 γ-H2AX的C末端磷酸肽结合，这样MDC1可以保护γ-H2AX去磷酸化而提高其DNA修复功能;此外，MDC1可通过其FHA结构域与ATM相互作用，从而促使更多的ATM聚集在DSBs周围，并使H2AX磷酸化，通过该机制可使DNA损伤信号放大［10］。一旦DSB发生，在断裂处H2AX就会发生磷酸化，形成γ-H2AX。然后MDC1这一适配体蛋白就会直接与γ-H2AX结合，这一步骤是细胞进行修复的关键。随后 RAP80、CCDC98/Abraxas及RNF8发生一系列转录后修饰的级联反应，以促使BRCA1定位到IRIF。有研究表明，RAP80在 DSB发生90～120 min后才重新定位于DNA损伤位点［2］，这说明RAP80是作为DNA损伤反应信号的下游调节者而发挥作用，其具体作用机制如下。

2.1 RAP80结构中的UIM功能 泛素化是一种重要的蛋白质修饰，其通过特异性地降解蛋白质，来调节细胞分化、调控转录、参与DNA损伤应答等。UIM不仅可通过调节蛋白单泛素化而影响其活性及功能，并且可通过识别单泛素化及多泛素化序列，而调节蛋白分子内及分子间的相互作用。RAP80氨基端包含两个UIM，其可直接结合泛素而促进RAP80的多泛素化过程。有研究表明，在电离辐射时缺失UIM的RAP80突变体无法定位于DNA损伤位点［8-9］;UIM基序中重要的氨基酸发生突变，RAP80则无法形成IRIF［11］。这些表明DSB发生时，RAP80及下游相关蛋白是通过RAP80结构中的UIM与泛素化相关蛋白作用，从而在损伤灶重新定位。

2.2 RAP80与细胞周期 RAP80可通过招募形成BRCA1-BARD1-BRCC36复合物定位于IRIF，来调节DNA损伤反应信号的传导。有研究表明，敲除RAP80表达可提高细胞对IR引起凋亡的敏感性，减少细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)的活性，损伤G2/M期检查点的调控作用［8-9］。

2.3 RAP80与BRCA1作用 BRCA1是一种重要的DNA损伤应答相关蛋白，它参与了DNA损伤修复过程，特别是在此过程中需要泛素的参与。BRCA1有一个关键的C末端结构域BRCT(carboxyl-terminal domain of BRCA1)，该结构域在突变修复过程中发挥着重要作用。BRCT为一个磷酸化肽结合结构域，可以与磷酸化的蛋白质有效结合，特别是对含有pSer-X-XPhe序列的蛋白质结合能力更强。约50%的家族乳腺癌患者和20%～30%的遗传性卵巢癌患者BRCA1基因发生突变，且大部分突变发生于BCRT结构域［11-12］。有研究发现，乳腺癌及卵巢癌患者BRCT结构域发生突变者BRCA1则无法与RAP80结合，这表明RAP80与BRCA1结合发挥作用需要BRCT结构域的作用。

然而RAP80并不包含可与BRCT结合的pSer-XX-Phe序列，这表明RAP80与BRCA1并不是通过直接结合而发挥作用，而是需要其它BRCT结合蛋白的辅助作用。随后经研究发现一种新型蛋白CCDC98，可以与BRCA1中的BRCT通过pSer-X-X-Phe而有效结合［13］。重要的是正是这种结合使RAP80被有效招募到BRCA1附近而形成复合体，从而参与对DNA损伤的修复，同时RAP80可以辅助BRCA1在IRIF发生后定位于准确的损伤位点。

BRCA1作为最早发现的乳腺癌抑制基因，它的突变可导致乳腺癌等相关肿瘤发生率明显升高，而RAP80是作为BRCA1发挥作用时的一个重要伴侣蛋白。低BRCA1、低Rap80水平的患者，其中位生存期显著延长，这说明Rap80对肿瘤化疗效果可能起关键性的调节作用［14］。

2.4 RAP80磷酸化 大部分参与IR导致的DNA损伤的蛋白均被ATM磷酸化［15］。RAP80也包含8个潜在的ATM磷酸化位点。已有报到证实其中3个(Ser101，Ser205，Ser402)在体外被 ATM 磷酸化［2，8，16］。但在不同的种属中，这些磷酸化的位点并非高度保守着。在UV引起的DNA损伤中，RAP80可被ATR磷酸化而发挥作用，这些表明RAP80在不同形式的DNA损伤中及细胞周期调控中均起着重要作用［12］。IR发生5 min后，RAP80即发生磷酸化，这一过程远远早于其定位于正确的损伤位点，其早期的磷酸化是否有着特殊的调节功能尚未明了。磷酸化可以影响蛋白之间的相互作用及蛋白的功能，但RAP80的多个磷酸化位点发生突变，并不影响RAP80与BRCA1的定位，据此可认为在IRIF发生时RAP80的定位并不依赖于ATM的磷酸化。因此，在DDR中RAP80的磷酸化可能有着尚未知晓的额外作用。

3 研究展望

由于RAP80在IRIF引起的DNA损伤修复中起着重要作用，因此目前关于其研究多集中于DNA修复及是否可成为新的肿瘤易感基因等方面。研究证实，大约5%～10%的不同类型肿瘤患者血清中含有RAP80抗体，因此可认为RAP80是一种新的肿瘤相关抗原［17］，而关于RAP80的其它功能如泛素化及转录等，研究较少。有研究表明在乳腺癌细胞中过量表达RAP80可减少ERα蛋白因泛素化作用而发生的降解，从而提高ERα蛋白水平以及ERα靶基因pS2的转录活性［5］。这些说明RAP80可能是ERα的关键调节因子，而ERα与多种肿瘤的发生均有密切关系，ERα的活化可促进肿瘤的生长、侵袭及转移。因此，RAP80很可能通过改变ERα蛋白水平和转录活性进而促进其下游基因的转录来调控肿瘤的发生和发展。这些为研究RAP80在肿瘤发生中的作用提供了新的方向。而RAP80在肿瘤中所起的作用也有待于进一步的研究。

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